Chapter 7. DNA
정제
- 3가지 DNA 준비 필요 : total cell DNA, plasmid DNA, phage DNA
1. Total cell DNA 준비
- Bacterial DNA 추출 1. Cell harvest 2. Cell lysis
3. DNA purification 4. DNA concentration
Chapter 7. DNA
정제
1) 세포추출물 제조
- 세포막 및 세포벽 제거 위한 약품처리 - 균종에 따라 다름
- lysozyme : peptidoglycan 제거
- EDTA : 세포외피 전체구조 유지에 필요한 Mg+2 제거, nuclease inhibition - SDS : lipid 제거 -> 세포막 파괴 야기
원심분리로 상등액 세포추출물 회수
Chapter 7. DNA
정제
2) 세포추출물에서 DNA 정제
- 세포추출물 내에 DNA, RNA, protein 포함
- 단백질 제거 : phenol, phenol+chloroform 혼합물 첨가 -> 단백질 응축 -> 제거 - 단백질농도 높을 때 : proetase, 처리 후 페놀 처리
- mRNA : 페놀처리로 제거
- 다른 RNA : ribonuclease 처리
Chapter 7. DNA
정제
3) DNA 농축
- ethanol precipitation : 염 존재하에 무수에탄올 처리 (-20oC) -> 고분자핵산 침전 - 유리막대를 이용한 DNA 섬유 회수
4) DNA 농도 측정
- UV abs @ 260nm -> A260 1.0 = 50µg/ml - A260/A280 = 1.8 인 경우 pure DNA
-> 1.8 이하이면 단백질, 페놀 오염
Chapter 7. DNA
정제
5) 박테리아 이외의 총세포 DNA 정제
- 세포벽, 세포 내용물의 차이에 따라 별도의 처리 필요 - 식물세포 : lysozyme 불필요 -> 액체질소동결 후 막
자사발
- 동물세포 세포벽 없음 -> 세제만 이용 - 식물세포
-> CRAB(cetyltrimethylammonium bromide) 처리법 - 핵산과 불용성 복합체 형성
- 원심분리로 복합체 회수
- 1M NaCl 용액에 녹여 DNA 정제 -> Guanidium thiocyanate 처리
- 핵산을 제외한 모든 생화학물질 변성, 용해 - silica 입자에 DNA 고정 후 회수
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정제
☞ 이온교환수지에 의한 DNA 정제 - cation exchange column 이용
Chapter 7. DNA
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2. Plasmid DNA 정제
- Ethanol 침전에 의한 DNA 농축까지는 동일 - 염색체 DNA로부터 plasmid DNA 분리 필요 1) 크기에 따른 분리
- 원심분리에 의해 세포단편과 함께 큰 사이즈 DNA 제거
- 세포막에 부착된 염색체의 경우 용이 - 조절된 용해에 의한 세포 파괴
-> 전체 DNA 파손 방지
-> sucrose 존재 하에 EDTA, lysozyme 처리 -> Triton X-100 처리 (비이온성 세제)
-> SDS(이온성세제)의 경우 염색체 파손
원심분리로 plasmid solution 얻음 (일부 염색체DNA 포함 가능성)
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2) 구조(conformation)차이에 따른 분리
- supercoiled vs unsupercoiled 구조 차이 유지 - DNA 정제 과정 중 염색체 DNA는 일부 파손 - plasmid의 supercoiling 상태 유지 필수
☞ alkaline denaturation
- unsupercoiled DNA : 좁은 pH 범위에서 변성됨 - supercoiled DNA : 안정
- pH 12.0 이상에서 변성 후 산 첨가에 의해 재집합
- 대부분의 단백질, RNA 함께 제거 - 페놀, ribonuclease 처리 불필요
Chapter 7. DNA
정제
☞ Ethidium bromide-CsCl 밀도기울기 이용 - 고속 원심분리에 의한 CsCl 밀도기울기 형성 - 밀도기울기 내 특정의 위치에 거대분자 띠 형성 - DNA 부력밀도 : 1.7g/cm3
- 단백질 : low , RNA : high
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☞ EtBr 처리 시
- DNA 분자 인접한 염기쌍 사이에 삽입 -> 선형 DNA의 경우 부력밀도를 크게 낮춤 - 선형 vs 원형 DNA -> EtBr-CsCl 기울기에서 별도의 위치에 띠 형성
- 튜브에 UV 조사하여 위치 확인 - 순수 plasmid 얻기에 효과적
- 결합된 EtBr은 부탄올로 추출, CsCl은 dialysis로 제거
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3) Plasmid multiplication
- multicopy plasmid(20 copy 이상) -> 단백질 합성 없이 복제 가능
- 일정 세포농도에서 단백질 합성 억제제(chloramphenicol 등) 첨가 후 12시간 배양 - 세포분열 없이 plasmid 복제
3. Phage DNA 정제
- 감염된 세균 배양액의 세포외 배지에서 파지입자 회수 - Capsid 제거에 의해 phage DNA 추출
- 문제점 : 낮은 titre(배양액 1ml 당 파지입자 수)
- Λ phage 의 경우 lysogenic : 세포외 phage 입자수가 적음
Chapter 7. DNA
정제
1) 높은 λ phage 입자를 얻기 위한 배양
- cl 유전자(phage를 integrated 상태로 유지시킴)의 온도민감성 돌연변이(clts) 개발
- 30oC : 정상 용원성, 42oC : clts 기능정지 -> 용균성
- 30oC에서 배양 후 42oC로 변환
- 다량의 파지입자 생산
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2) 비용원성 λ phage 정제
- 대부분의 λ phage 유래 벡터에는 cl 유전자 삭제
용원성 없음
- 세포 감염단계의 배양액상태가 중요 (세포성장속도와 감염속도의 균형유지)
- 세포의 지속적 성장 및 감염계속
- 궁극적으로 모든 세포 감염 및 용해
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3) 감염된 배양액에서 phage 수집 - 원심분리로 phage 현탁액 제조
- PEP(polyethyleneglycol) 첨가 후 원심분리 (PEP : 염 존재하에 물 흡수하는 긴사슬고분자)
4) Λ phage 입자에서 DNA 정제
- PEP 침전물 중 불순물 잔존(세포찌꺼기, 세포 DNA 등)
- CsCl density-gradient centfg 이용 phage 입자만 분리
- phage 입자의 단백질 제거
- 이하 동일한 DNA 정제과정 이용
Chapter 7. DNA
정제
5) M13 DNA 정제
- 별도의 처리없이 1012 titre 얻을 수 있음
- replicated form : plasmid 정제방법 이용 쉽게 정제 - 세포 용해가 없으므로 phage 현탁액의 오염 안됨 - 별도의 CsCl 이용단계 불필요
