Chapter 9. 살아있는 세포로 DNA 도입

Chapter 9.

살아있는 세포로

DNA

도입

- 재조합 DNA 제조 후 이들의 clone을 형성해야 함 -> 엄격한 의미의 cloning

- Cloning의 두 가지 목적 1) DNA 대량 공급

2) 재조합 DNA 분자 정제

☞ 일반적으로 하나의 세포는 하나의 DNA를 취함

☞ Clone : 동일한 분자만을 포함하는 세포

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DNA

도입

1. Transformation(형질전환)-박테리아 세포로 DNA 도입

- 모든 종류의 박테리아 : 배양배지로부터 DNA 도입 가능 -> 대부분 숙주에 의해 분해

-> 숙주에 의해 인식되는 ORF를 가질 경우 -> 복제

- plasmid의 도입과 안정한 유지 : plasmid 유전자의 발현 관찰로 확인 1) Competent cell

- 자연계의 형질전환 : 몇가지 종에서만 특이적 (Bacillus, Streptococcus 등) - 대부분의 박테리아 : 제한된 양의 DNA 만 도입

- DNA 도입능력을 강화하기 위한 물리적/화학적 처리 필요 -> competent cell : 이러한 처리를 받은 세포

2) Competent E coli 제조

- 50mM CaCl₂ 용액 처리 -> 세포에 DNA 결합 촉진

- 42℃ heat-shock -> DNA의 세포 속 이동 촉진

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DNA

도입

3) Transformant(형질전환체)의 selection

- competent cell 의 형질전환 효율이 매우 낮음 : 0.01%

- 대부분의 비형질전환체로부터 transformant를 선별해야 함 - plasmid 내의 selectable marker 유전자 이용

ex) pBR322

- ampicillin 변형 효소 (ß-lactamase) - tetracycline 해독 효소를 가짐

- pBR322 도입 -> ampstets 가 amprtetr로 바뀜 - amp, tet 포함배지에서 콜로니 형성 가능

- 제한배지에서 배양 전 세포 내 항생제 저항효소의

충분한 발현을 위한 pre-culture time 필요 (37℃, 1시간)

Ampicillin

Tetracycline

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도입

2. 재조합 분자의 확인

- 재조합 DNA 포함세포 vs self-ligated 벡터 포함 세포 구분

- plasmid 내 DNA 삽입 -> 유전자 손상 -> insertion inactivation(숙주세포 형질발현 실패) 1) pBR322에서 재조합 유전자의 선택

- tetracyclin 저항성유전자 중의 BamHI RS - 재조합 pBR322 DNA -> amp^Rtet^S

pBR322

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도입

☞ BamHI RS를 이용한 재조합 pBR322의 선별

- 형질전환 후 ampicillin 배지에서 배양 -> 콜로니 형성 : 모든 형질전환체(재조합 + self-ligation) 발현

- tetracycline 배지로 replica-plating

- 성장하는 세포 :

-> 삽입 DNA 없는 보통 pBR322 운반 세포 (amp^Rtet^R) -> 재조합 DNA amp^Rtet^S는 콜로니 생성 안됨

- 콜로니 위치 비교

- 처음 ampicillin plate 에서 amp^Rtet^S 위치 확인

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☞ BamH1 RS를 이용한 재조합 pUC8의 선별

- pUC8 : ampicillin 저항유전자, lacZ’ 유전자 가짐

- lacZ’ gene : lacZ(ß-galactosidase)의 변형체 -> 효소의 α-peptide 손실 - E. coli lacZ’^- mutant의 경우 pUC8을 획득할 때 정상적 효소 합성

- X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-galactopyranoside) + IPTG 배지에서 blue colony 형성

☞ pUC8 클로닝 과정

- ampicillin 배지에서 형질전환체 선별 - 재조합분자 확인을 위해 ß-gal 활성 검사

- 재조합 pUC8의 경우(lacZ’ 파괴) -> 흰색콜로니 형성

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3. 박테리아세포로 phage DNA 도입

- transfection or in vitro packaging에 의해 세포 내로 도입 1) Transfection

- plasmid transformation 과 동일 과정

- 정제된 phage DNA + competent cell -> heat shock

2) in vitro packaging

- 재조합 λ phage를 시험관에서 head-tail 구조로 조립 후 숙주세포에 감염

- 조립에 필요한 단백질 공급

☞ single-strain system : cos site에 돌연변이

-> concatamer(λ unit)는 제한효소에 의해 절단 안됨 -> 조립에 필요한 단백질은 계속 생산, 세포 내에 축적

☞ double-strain system

-> capsid protein 구성성분 중 하나에 돌연변이된 두 균주 -> 각 strain은 돌연변이단백질 외 나머지 정상 생산, 축적 -> 두 세포의 lysate 혼합 packaging mix 제조

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3) agar 배지에서 파아지 감염 확인 - plaque 형성 여부로 판단

- λ phage, M13 모두 plaque 형성

- M13의 경우 성장속도 지연으로 반투명 plaque 형성

4. 재조합 phage 확인

- 재조합 plaque를 분리하기 위한 방법들

1) phage vector 내 lacZ’ 유전자의 삽입 비활성화 이용 - lacZ’ 유전자 포함 phage 벡터 제조

- lacZ’ 유전자 속으로 새로운 DNA 삽입 - X-gal 한천배지에서 재조합 분자 확인

-> 정상적 phage : blue plaque -> 재조합 phage : 무색 plaque 2) λ cl 유전자의 삽입 비활성화

- 정상 plaque : lysogeny -> turbid - 재조합 plaque : lytic -> clear

3) Spi (sensitive to P2 prophage inhibition) 표현형

- 정상 λ phage는 P2 prophage를 가진 E. coli (Spi+)감염 안됨 - 새로운 DNA 삽입이 Spi-가 되도록 벡터 제작

-> 정상 λ phage -> 감염 안됨 -> plaque 형성 안됨 -> 재조합 λ phage -> Spi- -> plaque 형성

4) λ 유전체 크기 이용

- λ phage 조립을 위해서는 37~52kb의 DNA 만 이용 가능 - 37kb 이하 사이즈의 벡터 제작

-> 여분의 DNA 삽입(재조합) 후 파지입자로 조립 -> 정상 벡터 -> 파지 조립 안됨

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5. Non-bacterial 세포의 형질전환

- 대부분의 유기체는 세포벽을 가짐 - 동물세포

-> calcium phosphate에 의해 DNA 세포막에 침전 -> liposome 이용

- 세포벽 포함 세포

-> 세포벽 분해 후 protoplast 제조 -> DNA 도입 -> 분해효소 제거하면 순간적 세포벽 재생

- 기타 방법 : microinjection, biolistics