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3장. 산업용 배지

경북대학교 미생물공학연구실

KNUmbl

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발효공학 3장 : 산업용 배지

3-1. 배지 조성

1. 세포 생육을 위한 성분 : 미생물의 원소 조성

- 탄소원, 질소원, 무기원 : C, H, O, N, S, P, Mg, K, Ca, Cl---

* 연구용 배지 경우 당[탄소원], (NH4)2SO4[질소원,황], Na2HPO4+KH2PO4[인산]--- - 생육요구물질 (아미노산, 염기 또는 비타민) : 화학약품, 천연물(CSL 등)

* 균의 유전자형 및 표현형을 보고 생육요구물질 추가 - Ura^- 또는

ura

– 최소배지의 경우 uracil 첨가

- His^- - 최소배지의 경우 histidine 첨가

*

S. cerevisiae

S288c (

MAT

α

SUC2 gal2 mal2 mel flo1 flo8-1 hap1 ho bio1 bio6

)

* W303 (

MAT

a/

MAT

α {

leu2-3,112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11,15

)

MAT

a

leu2-3,112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11,15

MAT

α

leu2-3,112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11,15

* W3031a (

MAT

a

leu2-3,112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11,15

)

- 미량원소 : Fe, Cu, Zn, Co, Mo 등-천연수, 천연물에 함유-때에 따라 극미량 첨가

* 100x salts solution 조제 – 살균 – 배지에 1% 첨가

* 혼합한 경우 침전물이 생길 수 있음 – 문제가 되는 시약 따로 조제

* 살균하기 곤란한 경우 살균여과막으로 막여과하여 사용

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발효공학 3장 : 산업용 배지

2. 산물 생성을 위한 성분

1) 유도물질 또는 그 analog : 발효 기간 동안 일정 농도 유지

* 유도물질(inducer) : 산물의 생산을 유도하는 물질

* analog(ue) : 유연물질 = 유사물질 의미

가) lactose 첨가 배지에서 β-galactosidase & lactose permease의 활성 증가 --lactose 무함유 배지(예, 포도당 배지)의 경우보다 10⁵배

나) lactose 무함유 배지에서 배양중 lactose 첨가 --두 효소 활성 및 mRNA가 급격히 증가

* 두 효소가 lactose에 의해 induction(유도) - lactose가 유도물질(inducer)

* 유도효소(inducible enzyme): inducer(유도물질)에 의해 합성이 유도되는 효소

* gratutious inducer : inducer analog

-- inducer로서 작용은 하나 대사 되지 않는 물질 예) IPTG(isopropyl thiogalactoside)

: lactose analog – 유도 기능 유, 대사 불

Lactose IPTG

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2) 포도당 : 탄소이화물억제 유의 – 0.05% 이하 유지 또는 조절 해제 변이주 사용

* Glucose 및 lactose 배지에서 대장균 배양 : 계단성장 (diauxic graph)

두 효소 생산 거의 무 세포내 cAMP 함량 저

두 효소 생산

세포내 cAMP 함량 고

- Glucose 먼저 이용 후 lactose 이용 - Lactose가 있음에도 불구하고

glucose의 존재 하에 lactose 이용에 관여하는 두 효소의 합성이 억제 - Glucose 소모되고 나면 두 효소 유도

* 탄소이화물억제

(Carbon catabolite repression) - 두 종류의 탄소원이 존재할 때

이용이 용이한 탄소원의 존재로 인해 이용이 어려운 탄소원 이용 효소의 합성이 억제되는 현상

- 포도당 효과 (glucose effect)

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* lac operon

* 유전자의 구조

* Lactose에 의한 유도

* 탄소이화물 억제의 해제

β-galactosidase 유전자

lactose permease 유전자

transacetylase--기능 ? lacI: lac repressor 유전자, lacP: lac 프로모터(promoter), lacO: lac operator

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3) 질소원 :

- 대사 용이(Asn, Gln, NH4) – nitrogen catabolite repression(질소이화물억제) : 일부 항생물질 생산 저해

- NH4 : 아미노산의 막 투과 억제, 질산염 자화 억제 4) 무기원 : 일정 농도 유지 - 인산 등

5) 배지의 완충능 : 산물에 의한 pH 변화 시 매우 중요

* 완충액의 조성 첨가 - KH2PO4 + Na2HPO4 – 최소배지경우 대부분…

- 유기산 생성 시 산의 생성으로 pH가 급격히 저하 - Ca(OH)2 첨가 : ca-유기산염으로 침전

6) 전구물질 (precursor) : 조절의 해제가 목적

- 합성 대사의 경우 조절되는 경로 이후의 대사 중간산물 첨가하는 경우

7) 저해물질 : 불필요한 중간산물 감소, 최종산물의 분해 방지를 위해 첨가하기도 함

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3-2. 주요 배지원료

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발효공학 3장 : 산업용 배지

1. 탄소원

가. 포도당 또는 설탕 : 정확한 발효제어가 요구되는 경우 사용, 고가 - 일반적인 경우 원료당으로 대체

나. 맥아즙 (malt extract) :

1) 탄수화물 90-92% - 6탄당, 2당류, 3당류, dextrin - 곰팡이, 효모, 방선균 2) 단백질, 펩티드, 아미노산, 염기, 비타민 함유

-낮은 pH, carbonyl기, amino기 – 과열 시 Maillard 반응으로 수율 감소 원인 다. 전분 : 가장 널리 사용

1) 당화 : 묽은 산 (염산), 효소 (amylase 생산균, 맥아 이용) 가수분해 - 당화액으로 사용

2) 종류 : 옥수수, 쌀, 소맥, 감자, 고구마, 카사아버 전분 [갈아서 건조한것 : 타피오카]

***카사아버 : ..\카사아버.ppt

라. 아황산 펄프폐액 (Sulfite waste liquor) : 제지공업의 흑갈색 폐액 -환원당 약 2-3% 함유-효모의 배양, 에탄올 생산

-hexose (Glu, Man, Gal-침엽수 80%), pentose (Xyl, Ara-활엽수 70%)

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마. Cellulose : 세계 생산량 - 연간 10¹¹톤 생산 - 짚, 옥수숫대, 목재 폐기물, 폐지 등

- 산 또는 효소 가수분해, cellulase 유전자 이용

***biofuel : ..\바이오연료.ppt, cellulase : ..\cellulase.ppt 바. 유청 (milk whey) : 4-5% lactose

- 세계 연간 약 7,000만톤 생산- 56% 식사료용 이용 - 에탄올, 단세포 단백의 생산 - 저장 수송 비용 고

사. 유지 : 돈지, 대두유, 팜유, 면실유, 올리브 유 등-다른 탄소원 보조제로 사용 - 항생물질 생산에 식물성 기름 첨가 (oleic, linoleic, linolenic acid 함유)

: 탄소원 및 소포제 역할

아. 메탄올 및 에탄올 : 고순도의 원료 - 발효 후 추출, 분리 공정 용이 - 메탄올 : SCP의 생산 - 메탄올 자화능을 가진 효모, 세균

- 에탄올 : 초산, 식초의 생산

자. Alkane (n-paraffin) : 주로 C12-18

- 단세포 단백, 유기산, 아미노산, 비타민, 항생물질, 효소 등 - 원유가에 의해 유망 정도 변화

- 알코올류와 마찬가지로 고순도의 원료 : 발효 후 추출, 분리 공정 용이

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2. 질소원

가. 무기태 : 암모늄염 [(NH4)2SO4], 암모니아 가스, 일부 미생물의 경우 질산염 나. 유기태 질소 : 아미노산, 단백질, 요소 등 - 천연유기질소 복합체로 이용

1) CSL (Corn Steep Liquor) - 옥수수 전분 제조 부산물 - 전분 제조 : 물에 침지(steep)한 후 습식분쇄하여 분리

- 침지수 : 농축 – 질소 4% 정도 함유 - 다량의 아미노산 - 특히 알라닌 25%

2) Yeast extract : 아미노산, 비타민 고루 함유

- 빵 효모를 50-55℃에서 주로 자가분해 = 자가소화(autolysis)하여 제조 - 또는 고농도의 NaCl 존재 하 원형질 분리

3) Peptone : 동식물성 단백질 가수분해물 – 주로 peptide 함유 - 다양한 미생물에 이용 가능 –고가

- 가수분해 방법, 단백질 종류 따라 조성 상이 가) NZ amine : casein을 pepsin으로 분해 - 주

* Trypsin으로 분해하면 tryptone

나) HY case amine : casein을 산으로 분해 다) Soy peptone : 대두박을 pepsin으로 분해

4) 대두박 : 대두유 추출 잔사 : 단백질 50%, 탄수화물 30%

- 일본식간장의 주원료, 산 분해 간장의 원료

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3. 기타 성분

가. 무기염

- 천연 배지 첨가 필요 무, 합성 배지 적당량 첨가 - 필수적 : S, P, Mg, K, Ca, Cl 등

P : 핵산, ATP 등의 합성에 필요

S : 함황아미노산 (Met, Cys) 등의 합성에 필요 Mg : 특정효소의 작용에 필요-대사의 촉진 Na, K, Ca, Cl : 세포액의 삼투압 조절

- 주로 KH2PO4, Na2HPO4, MgSO4•7H2O, KCl 등 첨가 나. 비타민 : 세포의 대사 촉진에 필요

- 천연 배지 경우 첨가 무, 보통 부족 비타민 한 가지 - 원료의 배합 또는 순수한 비타민 첨가가 경제적

* 식초의 발효 배지 : Ca-pantothenate

Glutamic acid 발효배지 : thiamine chloride 다. 물 : 수질의 개선, 개량

- 대부분의 공장에서 지하수 사용-Ca, Mg 과량 함유-미생물의 증식 조절 곤란