Chapter 6.
유전자 클로닝과
DNA분석
1. 유전자 클로닝
- PCR의 발명과 함께 유전자클로닝 기술 급속 발전 1) 유전자 클로닝 실험의 기본 단계
Vector 내에 클론되어질 유전자 포함하는 DNA 단편 삽입 숙주세포로 vector 운반
숙주세포 속에서 벡터 복사-> 운반유전자도 함께 복사
숙주세포 분열-> 벡터복제 후 자손에 전달
Colony 형성 -> 클론 형성
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DNA분석
(1) 혼합물 가열(94oC) -> 이중가닥 DNA 분리 (2) 50oC – 60oC로 냉각 -> primer의 결합
(3) 74oC 로 승온 -> Taq polymerase의 최적 온도 -> DNA 합성
2) PCR
(4) 94oC로 가열 -> (1) 단계로 다음 싸이클 시작
25 cycle 후 5백만개의 새로운 이중 DNA 합성
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-클론되어질 DNA 단편 :
- 다른 단편 혼합물의 한 구성원 - 각 단편들은 다른 벡터에 삽입
- 하나의 재조합 DNA 분자-> 하나의 숙주세포로 운반 - 각 클론은 한가지 분자만을 포함
숙주세포로 vector 운반
숙주세포 속에서 벡터 복사-> 운반유전자도 함께 복사 3) 클로닝에 의한 유전자 분리
숙주세포 분열-> 벡터복제 후 자손에 전달
Colony 형성 -> 클론 형성
☞ 클론 집합체 중 특별한 클론 확인이 관건
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☞ 클론 집합체 중 특별한 클론 확인이 관건
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4) PCR에 의한 유전자 분리
-Target gene 만을 PCR로 증폭 -> transformation 숙주세포로 vector 운반
숙주세포 속에서 벡터 복사-> 운반유전자도 함께 복사
숙주세포 분열-> 벡터복제 후 자손에 전달
Colony 형성 -> 클론 형성
☞ PCR을 이용한 클로닝의 문제점
1. Primer 제작에 필요한 염기서열을 알지 못할 경우 2. PCR에 이용되는 유전자크기의 한계 -> 40kb
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2. 유전자 클로닝의 운반체
- 숙주세포 내에서 복제가 가능할 것 - 비교적 작은 사이즈-> 10kb 이하 - Plasmid, Bacteriophage
1) Plasmid
- a number of closed loops of DNA
- contain 2% of genetic information in bacterium - multiply independently of the chromosome - shown mostly in Gram- bacterium
- not essential for bacterial life but confer selective advantage
-> resistance to antibiotics, produce toxin (bacteriocin) to struggle for life
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☞ Selective marker로서의 plasmid
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☞ Plasmid의 복제
- 모든 Plasmid는 1개 이상의 복제시작점(ORF) 존재 - 작은 사이즈의 경우숙주세포 염색체에 삽입 후 복제
-> episome
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☞ Plasmid의 크기와 사본 수
- 다양한 사이즈, 1~ 50개 이상의 사본 수
☞ Plasmid의 분류
1. F plasmid : tra 유전자 (conjugation 조절 유전자)만을 운반 2. R plasmid : 항생제내성 유전자 운반, ex) RP4 in Pseudomonas
3. Col plasmid : colicin(다른 박테리아 저해)유전자 운반, ex) ColE1 in E. coli
4. Degradative plasmid : 특수 기질분자의 분해(toluene 등), ex) TOL in Pseudomonas putida 5. Virulence plasmid : 숙주세포에 발병, ex) Ti plasmid in Agrobacterium tumerfaciens
☞ 대장균의 경우 7종의 다른 plasmid 포함
☞ 진핵세포 plasmid : only found 2µm plasmid in Saccharomyces cerevisiae
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2) Bacteriophage
- lytic vs lysogenic cycle
- λ phage와 M13 phage 가 벡터로 사용 - λ phage : 전형적 용원성 파아지
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(1) λphage
- head-tail phage
- head 내에 DNA(49kb) 포함
- 기능별 유전자가 집단을 이루고 있음 -> 유전자를 그룹으로 on-off 할 수 있음 - 선형과 원형의 형태로 존재
-> 선형 :
- phage head 내의 DNA 형태
- 이중사슬 DNA 양쪽 말단에 상보적 cohesive ends(12 nucleotides)를 가짐 -> cos site
☞ cos site
- 주입된 선형 DNA를 원형으로 만듦 -> 박테리아 유전체 삽입에 필수 - prophage 에서 분리된 후 endonuclease를 위한 restriction site로 작용
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☞ λ phage의 선형과 원형
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(2) M13 phage - linear phage
- single-stranded circular DNA(6407 nucleotides) 포함 -> 적은 수의 유전자 - 숙주세포의 용균없이 바이러스 증식
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☞ M13 phage 복제
- 세포 내에서 single-stranded DNA가 template 역할 - 이중가닥 DNA로 된 뒤 복제 계속
☞ 벡터로서 M13 의 특징
- 10kb 이하의 크기 -> 표준형 벡터 사이즈 - replicative form은 plasmid 특성 가짐 - 단일가닥의 클론된 유전자 확보
- DNA sequencing, in vitro mutagenesis 등에 유익
