이를 이용하여 원하는 염기서열에 맞게 crRNA를 생산하면 원하는 유전자 부위만 변형시킬 수 있어 유전자 편집에 널리 활용될 수 있다. 본 연구에서는 Cas9보다 정교한 유전자 편집이 가능한 Cpf1을 이용하여 CRISPR-Cpf1 벡터 개발 연구를 진행하였다.
CRISPR-AsCpf1 발현을 위한 마우스 H1 promoter 분석
처리 후 세포가 정상적으로 생존함을 확인하였다. 마지막으로, H1 프로모터 5'의 GG, T, PARP-2 및 Kozak 서열을 모두 포함하는 H1 프로모터를 이용한 벡터인 Construct #5로 감염시킨 세포에서도 퓨로마이신을 처리하였을 때 세포가 생존하는 것이 관찰되었다(도 1B).
CRISRP system 발현에 “최적화”된 H1 promoter 제작
살아남은 세포의 gDNA를 확보하고 유전자 절단 활성 시험을 위한 T7E1 assay를 수행한 결과, construct #1 및 #3에 감염된 세포에서는 녹아웃 시 나타나는 heteroduplex로 인한 truncated band가 관찰되지 않았다. 컨스트럭트 #2, #3 및 #3으로 감염된 세포에서 녹아웃 형태가 확인되었다. 특히, Construct #5로부터 감염된 세포를 genotyping한 결과, 녹아웃으로 인해 main band의 강도가 약해지고 truncated band의 강도가 증가하여 유전자 축의 발현율이 높은 것으로 나타났다. 이 연구는 구조 #5를 사용하여 수행되었습니다(그림 1C).
H1 promoter를 이용한 AAV 벡터 제작과 발현테스트
단일 프로모터를 사용하여 CRISPR 시스템을 발현하는 pY108과 비교하여 AsCpf1 발현의 차이를 확인하기 위해 #5-v2를 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였고 AsCpf1 발현은 pY108보다 낮았습니다(그림 1C). 그러나 T7E1 assay 결과 가위의 활성에는 큰 차이가 없는 것으로 나타났기 때문에 H1 프로모터를 이용한 CRISPR-Cpf1 발현 시스템은 녹아웃 효율에 큰 영향을 미치지 않고 정상적으로 발현됨을 알 수 있다.
H1 promoter로부터 CRISPR-Cpf1 발현 단일 AAV 벡터 제작
단일 AAV 벡터를 사용한 다중 유전자 녹아웃. 그 결과 4개의 유전자 가위가 모두 정상적으로 발현됨을 확인하였다. CIITA 유전자 특이적 crRNA를 준비하고 유전자 가위 활성을 hiPSC(Human Induced Pluripotent Stem Cells)에서 테스트했습니다(도 13A).
생산된 모든 유전자 가위는 활성화된 것으로 나타났다. 멀티플렉스 crRNA 시스템을 사용한 인간 ATG5 유전자 녹아웃. 그 결과 유전자가위 4개 모두 활성을 보였다.
유전자 가위의 위치를 바꾸어 두 개의 벡터를 준비하였다.
CRISPR-Cpf1 system 발현의 poly A signal 영향 분석
단일 AAV 벡터를 이용한 다중 유전자 녹아웃
또한, 3개 유전자의 동시 녹아웃을 확인하기 위해 마우스 P53, Pten 및 Nf1 유전자 가위를 연결하는 삼중 crRNA 어레이를 사용하여 AAV-v2-bGHpA-TPN을 구축하였다. AAV-v2-bGHpA-TP를 이용한 T7E assay 방법과 유사하게 AAV에 감염된 NIH3T3 세포의 gDNA를 이용하여 T7E1 assay를 시행하였으며, 3개의 유전자가 동시에 녹아웃됨을 확인하였다. 이러한 결과는 AAV-v2-bGHpA를 사용하여 2개 또는 3개의 다른 유전자 가위를 동시에 발현함으로써 다중 유전자 녹아웃이 가능함을 입증했습니다.
Multiplex crRNA array system 수립
본 연구에서는 인간 ATG5 유전자를 표적으로 하여 실험을 수행하였다(도 8A). 다중 ATG5 녹아웃 crRNA 어레이에 사용할 단일 유전자 가위를 선택하기 위해 유전자의 엑손당 1~2개의 유전자 가위를 제작하였다. 단일 유전자 가위를 pY108 벡터에 삽입한 후 렌티바이러스로 구성하여 인간 간암 세포주 SNU475를 감염시켰다.
Multiplex crRNA array를 이용한 극대화된 녹아웃 세포주 제작
그 결과, 4개의 고활성 유전자 가위 CR1, CR2, CR4 및 CR6을 선택하여 crRNA의 하나의 다중 배열을 만들기 위해 가위를 조립하는 데 사용했습니다. 감염된 세포로부터 gDNA를 제공하고 다중 crRNA 어레이로부터 유전자 가위 발현 검정을 진행하기 위해, 어레이를 포함하는 각 유전자 표적 서열에 대해 T7E1 검정을 수행하여 crRNA에 의한 NHEJ 활성을 확인하였다(도 9B). 각 유전자 가위는 T7E1 assay로 multiplex crRNA array에서 정상적으로 발현되는 것을 확인하였으므로 AAV에 적용하기 위해 #5-v2 vector를 사용하여 bidirectional H1 promoter가 있는 ATG5 multiplex crRNA array의 expression assay도 수행하였다.
Lentivirus를 통한 Human Embryonic stem cell (hESCs)에서의 dimeric-crRNA
단일 H1 프로모터를 사용하여 AAV-v2 벡터에서 다중 crRNA 발현 시스템을 구현하는 것이 가능할 것으로 예상됩니다. 렌티바이러스에 의한 인간 배아 줄기 세포(hESCs)에서의 이량체 crRNA 발현 분석.
Dimeric crRNA 발현을 매개로 한 B2M-CIITA 녹아웃 hESCs 분석
얻어진 개별 클론의 gDNA를 이용하여 TA 클로닝으로 표적 서열을 분석하였다. 그 결과, B2M 및 CIITA 유전자 모두에서 프레임시프트 돌연변이가 유도 및 제거됨을 확인하였다(도 11A). 해당 염기서열을 증폭하는 한 쌍의 PCR 프라이머로부터 생산된 PCR 산물을 사용하여 Sanger 시퀀싱을 수행하였다.
B2M/CIITA 동시 녹아웃 hESCs로부터 분화된 hematopoietic stem cell (HSC)
따라서 이 실험을 계속하기 위해 CIITA 표적 유전자 가위를 조작했습니다. 향후 AAV CRISPR-Cpf1 시스템은 dimeric crRNA를 이용하여 동시 유전자 녹아웃 세포를 생산하여 표현형을 확인한 후 iPSC에서 사용할 계획입니다. P53 유전자를 제거하여 마우스 H1 프로모터의 효율성을 테스트합니다.
회색 상자는 유전자 가위에 의해 생성된 조기 정지 코돈에서 생성된 대체 판독 프레임을 나타냅니다. 멀티플렉스 crRNA 시스템을 생성하기 위한 인간 ATG5 표적 유전자의 가위 활성 분석. 인간 배아 줄기 세포(hESCs)에서 이합체 crRNA의 동시 발현으로 인한 서로 다른 유전자의 동시 발현 시스템.
신규 CIITA 표적 유전자 가위를 이용한 B2M/CIITA 동시 녹아웃 벡터 제작 (A) 새로운 CIITA 유전자 가위 제작을 위해 준비한 iPSC에서 단일 유전자 가위 발현 검사를 위한 T7E1 assay 결과입니다.
