ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.2. Методы исследования
На первом этапе исследования были собраны паспортные и анамнестические данные респондентов. Были собраны данные о модифицируемых и немодифицируемых факторах риска развития сердечно- сосудистых событий. Также, у всех исследуемых фиксировался возраст, пол, этническая принадлежность, данные экспертного анамнеза, антропометрические данные (вес, рост, на основании этого определялся индекс массы тела (ИМТ)), курения, употребление алкоголя, стиль питания.
Карта исследуемого представлена в ПРИЛОЖЕНИИ А.
Были проанализированы лабораторно-инструментальные данные: общий анализ крови, развернутый с лейкоцитарной формулой; показатели гемостаза:
растворимый фибрин-мономерный комплекс, протромбиновое время, протромбиновый индекс, ретракция кровяного сгустка, активированное частичное тромбопластиновое время, рассмотрены данные коронароангиографии.
Наше исследование было проведено в два этапа, так как являлось когортным проспективным исследованием. Всего в исследовании участвовали 163 пациентов, группа контроля – 91 практически здоровых лиц. Остальные по тем или иным причинам были исключены из исследований. На первом этапе все пациенты с острым коронарным синдромом проходили общеклиническое обследование, стандартное лабораторное обследование (ОАК, ОАМ, биохимическое обследование), электрокардиограмма, R-графия грудной клетки, чрескожное коронарное вмешательство, анализ крови на молекулярно-генетические маркеры. Вторым этапом оценивались конечные точки. Конечными точками были новые сердечно-сосудистые события:
повторные госпитализации (стенокардии, повторный ИМ), смерть от сердечно-сосудистых причин, повторная реваскуляризация, госпитализация по поводу ХСН, инсульт и некоронарная реваскуляризация с указанием сроков и причин завершения госпитализации, нарушение ритма и т.д. У всех пациентов забиралась кровь для изучения молекулярно-генетических маркеров.
Проведенный на последнем этапе статистический анализ и построение регрессионной модели позволили получить достоверные данные и сформулировать обоснованные выводы.
33
2.2.1. Генетическое исследование для определения полиморфизма генов кардиологического профиля (выделение человеческого ДНК методом высаливания)
Обследование проводилось при добровольном согласии исследуемого.
Молекулярно-генетическое исследование было проведено в Лаборатории коллективного пользования НАО «Медицинского университета Караганды».
Материалом исследования являлась венозная кровь пациентов и практически здоровых лиц.
Взятие крови на генетический анализ осуществлялось во время включения участника в исследование. Специальной подготовки к исследованию не требовалось. Кровь для молекулярно-генетических исследований забиралась однократно. В качестве биологического материала использовалась цельная кровь, полученная из локтевой вены исследуемого.
Образцы крови были собраны в вакутейнеры Becton Dickinson (BD Vacutainer) 2,7 мл, содержащие этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) калия производства США. После взятия крови пробирка несколько раз переворачивалась для предотвращения образования сгустков. Затем проводилось выделение ДНК из цельной крови методом высаливания.
Протокола метода высаливания был принят от авторов Миллер, Дюкec и Полески, 1988 г. [116]. Протокол выделения указан ниже.
Протокол выделения ДНК из цельной крови методом высаливания.
1) До начала выделения ДНК методом высаливания необходимо охладить низкоскоростную центрифугу Beckman со скоростью 2500 грm до 40 C в течении 15 мин;
2) Изолирование из ядер крови (кровь, собранная в пробирки с ЭДТА или ACD). В 15 мл полипропиленовую центрифужную пробирку вливаем 2,5 мл цельной крови, взятой с ЭДТА добавляем буфер А до верха;
3) Центрифугировать со скоростью скоростью 2500 грm до 40 C в течении 15 мин. После проведения осторожно слить супернатант, чтобы на дне или на стенке оставался осадок;
4) Ресуспендировать осадок ядер в 2,5 мл буфера Б размешать, добавить 300 µl 10% SDS и 30 µl протеиназы К (сток 10мг/ мл) (протеиназу К заранее размораживаем) и несколько раз переворачиваем;
5) Оставляем пробирки в термостате на сутки при температуре 370 С;
6) Через 24 часа берем пробирки, добавляем 700 мл насыщенного раствора NaCl в каждую пробирку. Хорошо перемешать в течении 10 мин;
7) Центрифугировать пробирки со скоростью 2500 грm течении 15 мин на низкоскоростной центрифуге Beckman;
8) Перенести супернатант в другую 15 мл прополиленовую пробирку (также можно в стеклянную для лучшей видимости ДНК преципетата), оставляя преципетированный осадок белков;
34
9) Добавить 1 мл ХЧ изопропанола (при 2 мл супернатанта) или же строго 0,6 мл (при 1 мл супернатанта) комнатной температуры и перевернуть пробирки несколько раз пока ДНК преципетат не станет видимым;
10) Извлечь ДНК с помощью пластикового шпателя или носика пипетки (можно расщепить немножко кончик носика, чтобы лучше наматывалась). Перевернуть чтобы изопропанол стек, подождать 20 -30 минут до некоторого высыхания;
11) Перенести в эпиндорфы, содержащие 300 µl TE буфера;
12) Оставить ДНК растворяться 2 часа при 370 С термостате перед измерением концентрации.
Через 2 часа берем эпиндорфы с ДНК перемешиваем в лабораторном вортексе (Vortex), затем измеряем концентрацию и степень очистки выделенной ДНК спектрофотометрически на наноспектофотометре P 330 (Implen). До дальнейшего использования образцы ДНК хранились при t = - 20оС.
Средняя концентрация выделенной ДНК составила 70,38 ± 80,19, отношение А260/А280 = 1,75 ± 0,16, отношение А260/А230 = 1,79 ± 1,29.
2.2.2 Генетическое исследование для определения полиморфизма генов кардиологического профиля (генотипирование)
Генотипирование проводилось методом, основанном на полимеразной цепной реакции в режиме Real Time. Метод исследования был выполнен в соответствии протокола производителя. Подготовка проб проводилась с использованием готовой смеси для ПЦР в режиме реального времени TaqMan® OpenArray® Genotyping Master Mix (Applied Biosystems).
Определение полиморфизмов генов осуществлялось с использованием системы QuantStudio TM 12K Flex Real-Time PCR (Applied Biosystems) на планшетах для генотипирования TaqMan® OpenArray® Genotyping Plate, Custom Format 64 QuantStudio TM 12K Flex (Applied Biosystems) с использованием генетического панеля кардиологического профиля (60 полиморфизмов в каждой). Планшеты заполнялись реакционной смесью при помощи автоматизированной станции QuantStudio TM 12K Flex Accufill System (Applied Biosystems).
Подготовка планшетов к ПЦР проводилась с использованием набора QuantStudio TM 12K Flex OpenArray® Accessories Kit (Applied Biosystems), пресса для планшетов OpenArray® Plate Press 2 (Applied Biosystems) и иммерсионного масла QuantStudio TM 12K Flex OpenArray® Immersion Fluid (Applied Biosystems).
Общий объем реакционной смеси составил 6 мкл, в котором 3 мкл 2×OppenArray Real-time master mix и 3 мкл ДНК концентрации 50 нг/мкл.
Анализ результатов ПЦР (QuantStudio 12K) проводился в облачном сервисе ThermoFisher (https://apps.thermofisher.com). Описания панели указаны в приложении (ПРИЛОЖЕНИЕ Е).
Результаты каждой ПЦР реакции были представлены в 2-мерном пространстве с целью визуальной оценки распределение на пулы. В данном
35
облачном сервисе можно было видеть дикий тип аллеля, а также мутационный тип аллеля. Кроме этого, была возможность проводить коррекции по распределению генотипирования аллелей. Результаты распределения генотипирования аллелей представлены на рисунках 3, 4,5,6.
Рисунок 3 – Распределение результатов генотипирования
36
Рисунок 4 – Некачественно проведенное генотипирование
Рисунок 5 – Генотипирование до ручного высчитывания аллелей.
Рисунок 6 –Генотипирование после ручного высчитывания аллелей.
После автоматической аннотации и визуального контроля, для каждой пробы (пациента) были определены генотипы, что также можно редактировать и загрузить результаты в MS Excell для дальнейшей статистической обработки данных.