Цель: определить значение показателей LBP и sCD14-ST как предикторов послеоперационных инфекционно-воспалительных осложнений у больных колоректальным раком. Оценить уровни LBP и sCD14-ST у больных колоректальным раком в зависимости от наличия или отсутствия SIRS, послеоперационных инфекционно-воспалительных осложнений, органных нарушений и летального исхода. Впервые на основании установленных критических уровней LBP и sCD14-ST разработана и внедрена новая методика определения риска негативных результатов оперативного вмешательства у больных колоректальным раком (Свидетельство о внесении сведений в государственный реестр прав на объекты авторского права № 29343 от 2022.10.2022).
Уровень и динамика LBP и sCD14-ST существенно зависят от клинико-морфологических особенностей колоректального рака, в частности от степени инвазии опухоли в стенку кишки и стадии опухолевого процесса, а также от наличия или отсутствия ОАК до операции. У больных колоректальным раком уровни sCD14-ST на 3-и сутки после операции при развитии отрицательных результатов достоверно выше, чем при. Установленные критические значения LBP и sCD14-ST позволяют выявлять больных с риском развития неблагоприятного исхода хирургического лечения колоректального рака.
Современное состояние проблемы колоректального рака ….…
Кишечная непроходимость обусловлена раком толстой кишки в 60% случаев, дивертикулами в 30% случаев, карциноматозом, эндометриозом, воспалительными заболеваниями кишечника и др. На долю оставшихся 10% операций приходится в среднем на 20% больше, чем после острых случаев [38, с.
Феномен бактериальной транслокации из кишечника
Наиболее распространенные бактерии, вовлеченные в БТ, принадлежат к семейству Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Klebsiella spp и др.), Enterococci и Streptococci spp.
Факторы, способствующие бактериальной транслокации из
Нарушения состава нормальной кишечной микрофлоры и
Уменьшение выделения желчи
Нарушения иммунитета
Циркуляторная гипоксия стенки кишечника и нарушение
Нарушение барьерной функции слизистой оболочки кишечника
Также было показано, что концентрация LBP в сыворотке связана с грамотрицательными, но не с грамположительными бактериями, поскольку уровни LBP были повышены только у пациентов с ДНК грамотрицательных бактерий [174]. В то же время выявлено статистически значимое повышение sCD14-ST в сыворотке крови крыс со всеми степенями внутрибрюшной гипертензии (p<0,01), что свидетельствует о достоверности этого маркера кишечной транслокации бактерий в системный кровоток [184]. В этой группе наблюдалось в 4 раза большее снижение уровня БС с течением времени, чем в группе КРР без ОАК, в то время как в группе неопухолевого ОАК БС со временем увеличивалось.
Это свидетельствует о том, что при возникновении острой кишечной непроходимости уровень sCD14-ST в сыворотке крови повышается, что свидетельствует об увеличении бактериальной транслокации. В зависимости от развития ССВО, послеоперационных инфекционно-воспалительных осложнений, летальности статистических различий в уровне и динамике sCD14-ST не выявлено (таблицы). Как и в предыдущих исследованиях, в данной работе уровни sCD14-ST были выше у больных с органными дисфункциями и в повышенной динамике у больных с органными нарушениями.
Уровень sCD14-ST до операции имел слабую положительную корреляцию с уровнем БНС на третьи сутки после операции, уровнем лейкоцитов и мочевины до операции, наличием/отсутствием ОАК при поступлении, а также слабую отрицательную корреляцию с уровнем лимфоцитов до операции (рис. 34). У больных КРР с развитием органных дисфункций уровень sCD14-ST на 3-и сутки после операции повышался в динамике на 30%, в то время как в. По результатам анализа у больных колоректальным раком LBP может использоваться как прогностический критерий развития SIRS, послеоперационных инфекционно-воспалительных осложнений, органных дисфункций и смерти, а sCD14-ST - как прогностический критерий развития органных дисфункций и смерти.
Кроме того, в сыворотке крови пациента с помощью ИФА определяют маркеры бактериальной транслокации - LBP (липополисахарид-связывающий белок) и sCD14-ST (рецептин). Однако в данном исследовании достоверно худшие исходы (ССВО, послеоперационные инфекционно-воспалительные осложнения, органная дисфункция и смертность) наблюдались у больных с более низким уровнем НАД на 3-и сутки и более значительным снижением во времени. В данном исследовании сравнение уровня sCD14-ST в динамике до операции и на 3-и сутки после не дало статистической разницы ни в одной из исследуемых групп.
Это свидетельствует о том, что при возникновении острой кишечной непроходимости уровень sCD14-ST в сыворотке крови повышается, что свидетельствует об увеличении бактериальной транслокации [216–218]. В данном исследовании статистических различий уровня sCD14-ST отдельно в каждой исследуемой группе в зависимости от развития ССВО, послеоперационных инфекционно-воспалительных осложнений и летальности не выявлено. Уровень sCD14-ST до операции имел слабую положительную корреляцию с уровнем лейкоцитов и мочевины до операции (0,274 и 0,328), наличием/отсутствием ОАК при поступлении (0,279), а также слабую отрицательную связь с уровнем лимфоцитов до операции (-0,270).
Отмечена также слабая положительная корреляция уровня sCD14-ST на 3-и сутки после операции с развитием послеоперационных осложнений (0,227), органной дисфункцией (0,274) и смертью (0,379), а также слабая отрицательная корреляция с уровнем лимфоцитов до операции (-0,267). У больных колоректальным раком LBP может использоваться как прогностический критерий развития SIRS, послеоперационных инфекционно-воспалительных осложнений, органной дисфункции и смерти, а sCD14-ST — как прогностический критерий развития органной дисфункции и смерти.
Теорий возникновения бактериальной транслокации
Основные биомаркеры бактериальной транслокации
Прямые способы определения БТ
Эти исследования показали, что наиболее часто передаются бактерии из семейства Enterobacteriaceae (преимущественно E. coli, в меньшей степени Klebsiella и Shigella), тогда как другие микроорганизмы встречались значительно реже и даже в единичных случаях (Staphylococcus aureus, коагулазонегативные стафилококки, Clostridium perfringens, Bacteroides fragilis, Pseudomonas aeruginosa, Lactobacillus). Ген 16s рРНК содержит гипервариабельные области, уникальные для каждого микроорганизма, и «строгие» области, общие для всех микроорганизмов. Они также сравнили два метода определения БТ (культура МЛУ и обнаружение 16s рРНК в МЛУ), это исследование показало, что несколько микроорганизмов могут одновременно транслоцироваться в мезентериальные лимфатические узлы, у одного пациента с отрицательной культурой МЛУ были положительные результаты ПЦР.
Сегодня идентификация 16s рРНК микробных сообществ человека сосредоточена на изучении биоматериалов, таких как фекалии, оральные и вагинальные мазки, которые содержат относительно большое количество бактерий и небольшое количество клеток человека [145].
Косвенные методы определения БТ
Он специфически взаимодействует с липидом А бактериального ЛПС, затем комплекс ЛПС-ЛСБ связывается с рецептором CD14 миелоидных клеток и способствует каскаду воспалительной реакции [172]. Каждый TLR выявляет специфические PAMP, для ЛПС - TLR-4, для бактериального липопротеина и пептидогликана - TLR-2, для неметилированной ДНК - TLR-9, для двухцепочечной РНК - TLR-3 и для одноцепочечной РНК - TLR-7 и -8 (рис. 5) [177]. Так, mCD-14 связывается с PAMP через TLR и активирует провоспалительный сигнальный путь, приводящий к продукции цитокинов (TNF, IL-1, IL-6 и IL-8) [178], фагоцитозу бактериальных патогенов, а mCD14 подвергается протеолизу с образованием катепсина DST, что выявляется по образованию катепсина DST. улация (рис.
TLR: толл-подобный рецептор; ЛПС: липополисахарид; LBP: связывающий ЛПС белок; MD2: Молекулярная динамика-2; ПСЭП: пресепсин. В то же время ЧСС максимально увеличивалась в первые сутки обструктивной кишечной непроходимости с умеренным снижением в динамике до 3-х суток непроходимости; на 5-е сутки уровень НАД в группе с обструктивной кишечной непроходимостью был выше, чем в контрольной группе (р = 0,01). При этом выявлена корреляционная связь между уровнем sCD14-ST и повышением внутрибрюшного давления как до операции (r=0,199; p=0,047), так и через 24 часа после нее (r=0,246; p=0,014), также уровни sCD14-ST повышались в зависимости от степени достижения максимальной артериальной гипертензии у 4.
Дизайн исследования
В таблице 15 приведены статистические показатели уровня sCD14-ST до операции и на 3-и сутки после нее для каждой исследуемой группы. В серии исследований авторы установили, что sCD14-ST обладает значительной диагностической точностью при сепсисе, коррелирует с тяжестью сепсиса и изменениями показателей органной дисфункции, а также является предиктором исхода и риска смерти [20, стр. Выявлена слабая отрицательная корреляция уровня НАД на 3-и сутки после операции с развитием ССВО, послеоперационными осложнениями, органными дисфункциями и смертью; также наблюдалась положительная слабая корреляция с уровнем sCD14-ST до операции (рис. 33).
Отмечена также слабая положительная корреляция уровня sCD14-ST на 3-и сутки после операции с развитием послеоперационных осложнений, органных дисфункций и смерти, а также слабая отрицательная корреляция с дооперационным уровнем лимфоцитов (рис. 35). Учитывая тот факт, что генез ОАК не влиял на уровни маркеров в зависимости от развития ССВО, послеоперационных осложнений, органных дисфункций и летальности, для определения прогностической значимости БНС и sCD14-ST была проанализирована суммарная группа больных КРР (с ООК и без нее). При повышении уровня sCD14-ST от исходного до операции риск развития органных дисфункций выше в 6,5 раза.
Также у больных КРР выявлена слабая отрицательная корреляция уровня БС на 3-и сутки после операции с развитием ССВО (-0,277), послеоперационными осложнениями (-0,304), органными дисфункциями (-0,317) и летальным исходом (-0,232), также наблюдалась слабая положительная корреляция sCD1 до операции. Они обнаружили, что высокие уровни sCD14-ST были связаны с более высокой долей активированных клеток CD8 у пациентов с рецидивом или прогрессированием заболевания.
Материал исследования
Методы исследования
Методика забора, транспортировки и хранения мезентериальных
Отделите 20 мг ткани от каждого доставленного образца в стерильных условиях в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл для последующего выделения ДНК. Храните материал (20 мг в микроцентрифужной пробирке, а оставшийся материал в стерильном вакутайнере) при температуре от -20°C до -80°C до тех пор, пока не начнется выделение ДНК.
Методика забора, транспортировки и хранения венозной крови
Детекция бактериальной транслокации
Выделенную чистую культуру микроорганизмов идентифицировали методом времяпролетной масс-спектрофотометрии с матрично-ассоциированной лазерной десорбцией и ионизацией (MALDI-TOF MS) с использованием системы Microflex LT, а также программного обеспечения MALDI Biotyper Compass 4.1.80 (Bruker Daltonics, Германия) (рис. 11). Затем прибавляли 2 мл насыщенного раствора альфа-цианотетрагидроксикоричной кислоты в 50% ацетонитриле и 2,5% трифторуксусной кислоте, снова сушили при комнатной температуре и помещали в масс-спектрометр [194, с. По результатам предыдущих ПЦР-исследований с универсальными праймерами 16s рРНК можно обнаружить большинство бактерий, так как праймеры связываются с общими для большинства бактерий сайтами [143, с.
Молекулярно-генетическую детекцию микроорганизмов в лимфатических узлах больных проводили с помощью ПЦР в реальном времени на амплификаторе BIO-RAD CFX96 (рис. 12). Для имитации транслокации микроорганизмов при МЛУ к полученным образцам лимфатических узлов при комнатной температуре (до 120 минут) добавляли взвесь лабораторного авирулентного штамма Escherichia coli GFP 6 серотипа биотипа 1 (АТСС®. 25922GFP™) со значениями КОЕ от 108 до 102.
Затем образцы промывали 500 мкл промывочного буфера I и 500 мкл промывочного буфера II путем центрифугирования после каждого добавления. Перед добавлением 200 мкл элюирующего буфера спин-колонку помещали в стерильную микроцентрифужную пробирку с последующей инкубацией 2 мин при комнатной температуре и центрифугированием 1 мин при 8000 g. После амплификации также проводился анализ кривых плавления (плавления) от 70°С до 90°С с шагом 0,4°С, который предназначен для определения различий в нуклеотидных последовательностях (определение специфичности полученного продукта амплификации – бактериальной ДНК) [188, с.
Первую группу составили образцы чистой культуры E. coli в количестве КОЕ/мл в физиологическом растворе (0,9% раствор NaCl) - по 5 образцов каждого из значений КОЕ, всего 20 образцов. 357-362], а sCD14-ST идентифицирован как биомаркер ранней фазы сепсиса, а его уровень является значимым предиктором исходов у пациентов с сепсисом [24, с. Исследование LBP, sCD14-ST проводилось на базе Лаборатории коллективного пользования Научного центра НАО.
Методика определения маркеров в сыворотке крови выполнялась согласно разработанной СОП «Описание методики определения sCD14-ST и LBP в сыворотке крови методом ИФА» (Приложение Ж) [188, с.
Статистические методы
Культура мезентериальных лимфатических узлов
Но поскольку культура МЛУ выявляет только жизнеспособные бактерии, а для обнаружения небольшого количества микроорганизмов в МЛУ необходимо усиление роста бактерий триптиказным соевым бульоном, мы провели ПЦР-исследование МЛУ на наличие бактериальной 16s рРНК.
Определение 16S rRNA в мезентериальных лимфатических узлах…
Качественное определение наличия микроорганизмов в
Количественное определение наличия микроорганизмов в
Большинство исследований по определению 16s РНК бактерий были сосредоточены на изучении материалов, содержащих относительно большое количество микроорганизмов и небольшое количество клеток человека, это: фекалии, оральные и вагинальные мазки [145, с. Поэтому для изучения транслокации микроорганизмов при МЛУ (рис. 25) мы использовали математическую модель второй калибровочной группы (суспензия E. coli и МЛУ). В результате ПЦР-диагностики образцов МЛУ, исследованных у больных с неопухолевым ОПП, результат ПЦР был отрицательным во всех 5 случаях, при этом у больных с МЛУ 53 он был отрицательным, а у больных с МЛУ не бих 7 (рис. 26).
Так, выявление 16s рРНК бактерий при МЛУ методом ПЦР, как прямого метода исследования БТ, дало положительный результат только в 13,2%, что связано с ограничением метода при низком уровне КОЕ микроорганизмов в мезентериальных лимфатических узлах.
Уровень LBP и sCD14-ST до и на 3-и сутки после операции не зависит от локализации и степени клеточной дифференцировки опухоли, а зависит от степени инвазии опухоли в стенку кишки и стадии опухолевого процесса.
