http://www.enu.kz УДК 663.15
ВЛИЯНИЕ в-ГАЛАКТОЗИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ДРОЖЖЕЙ ВИДА KLUYVEROMYCES LACTIS НА СИНТЕЗ ОЛИГОСАХАРИДОВ В МОЛОЧНОЙ
СЫВОРОТКЕ
Сәуірбаева А.Т., Кукишева А.А., Турумбетова Ж.Ж.
Казахский национальный аграрный университет, Алматы, Казахстан, [email protected]
http://www.enu.kz
Сегодня в мире известно более 20 различных олигосахаридов, из которых доказанным пребиотическим эффектом обладают лактулоза, лактитол, соевые олигосахариды, лактитол-олигосахариды, фруктоолигосахариды, галактоолигосахариды и др. Методы получения олигосахаридов основаны на прямой их экстракции из растительного сырья, ферментативном либо кислотном гидролизе полисахаридов соответствующего состава, ферментативном либо химическом синтезе из простых углеводов [1]. Галактоолигосахариды (олигогалактозиллактоза, олигогалактоза, трансгалактоолигосахариды) являются производными лактозы и в натуральном виде содержатся в грудном молоке и тканях некоторых растений, например лука, чеснока, соевых бобов, цикория, топинамбура. Галактоолигосахариды, как и другие олигосахариды, практически не разрушаются в верхних отделах желудочно-кишечного тракта, в неизмененном виде поступают в толстую кишку, где и ферментируются присутствующей там микрофлорой, преимущественно бифидо- и лактобактериями, реализуя свое пребиотическое действие. Галактоолигосахариды стимулируют перистальтику кишечника и устраняют его дисфункции, способствуют усвоению кальция и магния, активируют специфические и неспецифические системы защиты макроорганизма, оказывая не связанное с жизнедеятельностью кишечной микробиоты иммуномодулирующее, гипохолестеринемическое и гипогликемическое действие, снижая риск развития кариеса и опухолей. Сегодня галактоолигосахаридами обогащают детское питание, фруктовые соки, безалкогольные напитки, молочные продукты, сухие завтраки, корма для животных и т. д. [2].
Наиболее перспективным и экологически безопасным способом получения галактоолигосахаридов является ферментативное трансгликозилирование лактозы in vivo и in vitro с участием в-галактозидазы. В качестве наиболее доступного и дешевого источника получения олигосахаридов, на наш взгляд, выгодно использовать молочную сыворотку. Применение сыворотки, содержащей олигосахариды, в производстве про- и пребиотических продуктов , позволит решить одну из главных проблем отрасли - расширение ассортимента и увеличение объемов производства продуктов функционального питания. Молочная сыворотка – побочный продукт производства сыров, творога, казеина и других молочно-белковых продуктов. Мировые ресурсы этого вида сырья исчисляются десятками миллионов тонн в год, тогда как степень утилизации сыворотки в перерабатывающей промышленности и сельском хозяйстве ничтожно мала. В молочной сыворотке углеводом, пригодным для спиртового брожения, является лактоза.
Лактоза – дисахарид, при гидролизе распадающийся на глюкозу и галактозу. Характерной особенностью лактозы является ее медленное расщепление в организме. В то же время взрослый организм человека и животных зачастую неспособен усваивать лактозу, что связано с потерей способности продуцировать в-галактозидазу – фермент, расщепляющий молочный сахар на моносахариды. В связи с этим актуальным является изучение физиологических свойств коллекционных культур, в частности лактозосбраживающих дрожжей рода Kluyveromyces. Одной из наиболее ценных групп культур, представляющих интерес для биотехнологической промышленности, являются дрожжи вида Kluyveromyces lactis, сбраживающие лактозу молочной сыворотки до этанола.
http://www.enu.kz Поэтому в наших работах объектами исследования служили штаммы лактозосбраживающих дрожжей вида Kluyveromyces lactis, поддерживаемых методами лиофилизации, криоконсервации и субкультивирования. Дрожжевые грибы вида K. lactis сохраняют высокий уровень сбраживающей активности и продукции этанола на молочной сыворотке при хранении различными методами. Подтверждено, что метод хранения не влияет на морфологические характеристики культуры. Высокие результаты выживаемости получены при культивировании дрожжей, хранившихся методами субкультивирования и криоконсервации. Лишь немногочисленные представители дрожжевой флоры способны утилизировать лактозу молочной сыворотки брожением [3].
в-галактозидаза (лактаза, в-галактозид-галактогидролаза) – фермент класса гидролаз, катализирующих отщепление концевого нередуцированного остатка в-D-галактозы в в-D- галактозидах, в том числе в составе лактозы. Фермент обнаруживается в некоторых растениях, физиологической нормой представляется также его наличие в тканях органов человека и животных, однако наиболее распространенным источником в-галактозидазы являются микроорганизмы различных таксономических групп.
По исследованиями Хамагаевой И.С. было доказано, что трансгликозилирующая активность Я-галактозидазы способствует накоплению в молоке олигосахаридов.
Показано, что олигосахариды индуцируют синтез собственной Я-галактозидазы у бифидобактерий, которые способны активно сквашивать молоко без добавления факторов роста. В результате катализируемой ферментом реакции трансгликозилирования из лактозы образуются галактоолигосахариды различной степени полимеризации [4]. Среди факторов, оказывающих влияние на ферментативные процессы, особое место занимает концентрация самого фермента. Известно, что скорость биохимических реакций определяется числом столкновений реагирующих молекул и ионов, т.е. сближением на расстояние, в пределах которого проявляются силы их взаимодействия. Надо полагать, что при выбранной концентрации субстрата увеличение количества фермента с одинаковой активностью будет ускорять ферментативные процессы. Однако определение минимальной дозы фермента, обеспечивающей наибольший выход продуктов реакции, в практическом аспекте имеет решающее значение [5].
Результаты исследований влияния концентрации фермента на образование олигосахаридов в сывороточном концентрате представлены в рисунке 1. Условия ферментации: концентрация лактозы - 42%; продолжительность - 3 ч; температура - 30°С; рН 6,8. Из таблицы видно, что увеличение дозы Я-галактозидазы до 20 Е на 1 мл сыворотки повышает концентрацию олигосахаридов в сгущенной сыворотке. Однако дальнейшее увеличение концентрации фермента лишь ускоряет гидролитические процессы.
Так, синтез олигосахаридов уменьшается с 12 до 7,5%, а содержание глюкозы и галактозы увеличивается до 15 и 12.8% соответственно.
http://www.enu.kz
Рисунок 1 − Влияние концентрации фермента на образование олигосахаридов в сывороточном концентрате
Анализ полученных данных дает основание считать оптимальной дозой фермента, обеспечивающей максимальный выход олигосахаридов при температуре 30°С, 20 Е на 1 мл сыворотки. Эффективность биотехнологических процессов во многом определяется длительностью получения конечного продукта. При изучении ферментативных процессов важно установить время достижения максимального эффекта, в противном случае может измениться направленность реакции (синтез побочных продуктов, изменение свойств целевого продукта и др.). Результаты исследования влияния продолжительности ферментации сывороточного концентрата Я-галактозидазы на выход олигосахаридов и степень гидролиза лактозы представлены на рисунке 2. Как показывает рисунок, степень гидролиза лактозы возрастает в течение всего периода ферментации и достигает наибольшего значения к концу эксперимента. Кривая синтеза олигосахаридов имеет иной характер. Так, через 2 ч ферментации в реакционной среде обнаруживается максимальное количество олигосахаридов. Дальнейшее увеличение продолжительности ферментации приводит к уменьшению содержания олигосахаридов, что, вероятно, связано с последующим их гидролизом.
Результаты данной серии эксперимента показали, что продолжительность ферментации сгущенной сыворотки в течение 2-х часов при заданных условиях концентрацией лактозы-42%;
при температуре -30 °С; рН 6,7 является наиболее оптимальной.
8
5,2 4,5
3 12
15
9
7,5
11,8 13 11
15
7,8 8,5
10
12,8
0 2 4 6 8 10 12 14 16
0 5 20 30 40 45
%
доза фермента, Е/мл сыворотки
лактоза,% олигосахариды, % глюкоза, % галактоза, %
http://www.enu.kz
Рисунок 2 − Влияние продолжительности ферментации на степень гидролиза лактозы и образование олигосахаридов: доза фермента - 20 Е на 1 мл концентрата;
концентрация лактозы-42%; температура-30 °С; рН 6,7
В результате исследовании было также установлено, что под действием -галактозидазы максимальный синтез олигосахаридов отмечен при температуре 30°С, концентрации фермента 20Е на 1 мл сыворотки, концентрации лактозы 42 % и продолжительности ферментации в течение 3ч. Выделены и идентифицированы олигосахариды, 54% которых представлены дисахаридами, в том числе содержание аллолактозы составило 34%.
Список использованной литературы:
1 Дудикова Г.Н. Коллекция культур микроорганизмов для пищевой и перерабатываемой промышленности //Биотехнология. Теория и практика. – 2001. − №3 −4. − С.79 −82.
2 Просеков А.Ю. Современные аспекты производства продуктов питания/
А.Ю.Просеков. – Кемерово: Кузбассвузиздат – АСТШ – Университеты России, 2005. – 370 с.
3 Серикбаева А.Д. Изучение состава и свойств молочной сыворотки //Здоровье и болезнь. − Алматы, 2009. − № 5 (81).−С.129− 131.
4 Хамагаева И.С. Теоретическое обоснование и разработка технологии кисломолочных продуктов на основе использования − галактозидазы и бифидобактерий: дисс... докт. техн.
наук. − М., 1996. − 456с.
5 Synthesis of galactooligosaccharides from lactose using beta-galactosidase from Kluyveromyces lactis: Studies on batch and continuous UF membrane-fitted bioreactors / S.
Chockchaisawasdee [et al.] // Biotechnol. Bioeng. – 2005. – Vol. 89, N 4. – P. 434–443.
15
27
35
45
58 63
5
21 18 22
13 8
0 10 20 30 40 50 60 70
30 60 90 120 150 180
%
продолжительность ферментации, минут
степень гидролиза лактозы, % количество олигосахаридов, %
