УДК 616.342.002.44.07:085
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА ИНТЕРЛЕЙКИНА-1 У БОЛЬНЫХ ЯЗВЕННОЙ БОЛЕЗНЬЮ И ХРОНИЧЕСКИМ ГАСТРИТОМ, АССОЦИИРОВАННЫМИ С
HELICOBACTER PYLORI Исабекова Т.М.
ЕНУ им.Л.Н.Гумилева, г.Астана, Казахстан [email protected]
Научный руководитель: доктор PhD Омаров Р.Т., доктор PhD., с.н.с. ННЛБКП НЦБ РК Кулмамбетова Г.Н.
Цель работы: изучить полиморфизм генов интерлейкина-lß у казахской популяции.
Материалы и методы: в работе были использованы штаммы с различных областей РК.
Выделение ДНК из крови. Образцы геномной ДНК выделяли из цельной крови пациентов. Для выделения ДНК к одному объему крови добавляли четыре объема 0,8%
NH4Cl (раствор для гемолиза). Полученный раствор перемешивали 5-6 раз, инкубировали 10мин при комнатной температуре. Центрифугировали 30сек при частоте 12тыс. об/мин, супернатант сливали. Добавляли к осадку 1 мл 0,8% NH4Cl, перемешивали пипетированием, центрифугировали 30 сек. На 12тыс. об/мин, супернатант сливали. Еще раз добавляли к осадку 1 мл 0,8% NH4C1, перемешивали пипетированием, центрифугировали 30 сек. при 12тыс. об/мин, супернатант сливали. К осадку добавляли один объем CLB (Cell Lysis Buffer), перемешивали пипетированием до полного лизиса.
Добавляли 3 мкл раствора РНКазы, перемешивали и инкубировали 5 минут при 37°С, охлаждали до комнатной температуры. К раствору добавляли половину объема PPT (Protein Precipitation Buffer), перемешивали на вортексе до полной гомогенности, центрифугировали 5 мин. при 12тыс. об/мин. Супернатант отбирали в новые пробирки и добавляли полтора объема изопропанола, в результате образовывалось две фракции.
Жидкость перемешивали, переворачивая пробирку 5-6 раз до образования белой пленки.
Ставили в морозильную камеру на 10минут, затем центрифугировали 10 мин. при 12 тыс.
об/мин. Супернатант сливали, к осадку добавляли 1 мл 75% этилового спирта, перемешивали и центрифугировали 5 мин. при 12 тыс.об/мин, супернатант сливали.
Повторяли процедуры с этанолом еще раз. Осадок высушивали при 56°С с открытыми крышками. Добавляли к осадку 100 мкл ТЕ буфера, оставляли на 10 минут при комнатной температуре, затем прогревали 15 минут при 56°С. Полученный раствор хранили в морозильной камере при -20°С. Для получения рабочей концентрации ДНК, раствор концентрированной ДНК разводили деионизованной водой в необходимое количество раз.
Амплификацию фрагментов генома штаммов Helicobacter pylori проводили в реакционной смеси, содержащей: Tris-HCl (рН 8.8), (NH4)2S04, MgCl2, dNTP, forward, reverse primers, деионизованная вода (ddH20), Taq-pol, «Promega». Реакцию проводили в амплификаторе Tetrad 2 Biorad. Программа амплификации: 93 °С в течении 2 мин и проводили 39 циклов:
денатурация при 93 °С - 10сек, отжиг 60 °С - 20 с и элонгация при 72 °С - 20 с .Электрофорез проводили в 2% агарозном геле.
Дефосфорилирование.Компоненты (на 10 образцов): 1 мкл щелочной фосфатазы (Shrimp Alkaline Phosphatase (Fermentas,Литва), 5 мкл 1х ПЦР-буфера и 44 мкл ddH20. Компоненты перемешивали и добавляли по 5 мкл к каждому образцу. Плашку заклеивали пленкой, центрифугировали до 700 об/мин и ставили в амплификатор. Программа: 37 °С - 30 мин, 85 °С - 10 мин, 4 °С 5 мин.
Минисеквенирование: для определения генотипа были подобраны специальные зонды:При минисеквенировании использовалась смесь (на 10 образцов), содержащая IL - ip(-511C/T): 5 мкл 10х ПЦР-буфера, 40 мкл ddH20, 1 мкл ddCTP (10пмоль/мкл),
1 мкл dTTP(10 пмоль/мкл), 1 мкл ddGTP (10 пмоль/ мкл), 1,1 мкл зонда (5 пмоль/ мкл).
Все компоненты смешивали, добавляли 0,6 мкл термоустойчивой ДНК-полимеразы (TermiPol DNA Polymerase (Solis Biodyne, Эстония)и перемешивали пипетированием.
Добавляли к 5 мкл смеси 5 мкл анализируемого продукта полимеразной реакции, центрифугировали до 700 об/мин и ставили в амплификатор.
Программа: 39 циклов 93 °С - 5 сек, 55 °С - 10 сек, 72 °С - 5сек.
Статистическая обработка данных проводилась с помощью программы приложения Microsoft - Statistica 6.0. Для установления достоверности различий при сравнении результатов для переменных с нормальным распределением использовался t-критерий Стьюдента. Данные представлены как среднее стандартное отклонение для переменных с нормальным распределением. Критерием достоверности считалось р<0,05.
Для расчета чувствительности и специфичности прогностических признаков, а также прогностической ценности положительного результата теста (наличия признака) и отношения шансов выстраивалась четырехпольная таблица с последующим определением показателей.
Результаты: выявлены все три возможных генотипа: гомозиготные по С-аллелю, гомозиготные по Т-аллелю, и гетерозиготные, несущие и С и Т аллели. В нашем исследовании, в обеих группах больных статистически достоверно чаще выявлялись пациенты гомозиготные по С-аллелю - 47,6% в группе ITT и 47,4% в группе закончивших исследование. Распространенность генотипа С/Т имела промежуточное значение - 39 и 38,5 %, соответственно. Достоверно реже выявлены пациенты гомозиготные по Т-аллелю:
13,4 и 14,1% соответственно.
Список литературы:
1. Громова А. Ю., Симбирцев А.С. Полиморфизм генов семейства IL-1 человека//Цитокины и воспаление. -2005. -№5. - С. 10-12.
2. Ивашкин В.Т. Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии. // Мед. кафедра. - 2005. - №1. - С.4-17.
3. Ковалева О.Н., Амбросова Т.Н. Биологические эффекты интер- лейкина-1 // Врач, практ. - 2001. - № 2. - С.94-98.
4. Роккас Ф. Инфекция Helicobacter pylori как фактор риска рака желудка: современные доказательства // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол. и колопроктол. - 2002. - №3 (12). - С.66-70
5. Baumann P., Jonzier-Perey M., Koeb L., Kupfer A., Tinguely D., Schopf J. Amitriptyline pharmacokinetics and clinical response: II. Metabolic polymorphism assessed by hydroxylation of debrisoquine and mephenytoin // Int. Clin. Psychopharm. - 1986. - Vol.1 - P. 102-112.
6. Dinarello C.A. Biologic basis for interleukin-1 in disease. // Blood. - 1996. - Vol.87 - P.2095- 2147
![Ключевые слова: периферические, центральные лимфоидные органы, миграционная способность.
Лимфоидная ткань мгновенно реагирует на любые стрессовые воздействия, играет существенную роль в процессе гомеостаза. Так отмечена возможность лимфоидного пика в активации кроветворения, установлены изменения физиологических свойств и клеточной популяции лимфоидной ткани костного мозга, способствующие повышению резистентности организма эмоциональном стрессе [1,2].
Характерной чертой радиационного воздействия является длительное сохранение повреждений в отдельных звеньях системы иммунитета и сопряженных с ним отдаленных последствий и осложнений, проявляющихся в ускорении процессов старения, быстрым прогрессированием хронических заболеваний внутренних органов, латентно протекающих в период формирования, а также развитием злокачественных новообразований [3,4,5].
При действии высоких доз радиации в ближайшем периоде отмечается иммуносупрессия в различных звеньях иммунной системы, приводящая к иммунодефицитному состоянию [7,8,9], тогда как в отдаленном периоде после сублетального гамма излучения изменения в периферических лимфоидных органах иммунной системы представляет большой интерес, так как не изучалось состояние селезенки и лимфатических узлов тонкого кишечника в отдаленном периоде после воздействия сублетального гамма-излучения.
Целью работы явилось изучение функционального состояния селезенки и лимфатических узлов тонкого кишечника в отдаленном периоде после острого воз-действия гамма-излучения.
Материал и методы исследования
Для решения поставленной цели нами были выполнены 4 серии опытов на 115 белых беспородных половозрелых крысах. 1 серия – интактные (n=15), 2-я серия и 3-я серия облученные сублетальной дозой гамма-излучения 6 Гр. через 1 (ближайший период) и 3 месяца (отдаленный период) соответственно, 4 – облученные + эмоциональный стресс.
2, 3 и 4 серий животных подвергли общему облучению на радиотерапевтической установке «Луч-1» мощностью 125 Р в час гамма-лучами 60Со в дозе 6 Гр. Во время облучения животные находились в специально сконструированной камере из органического стекла, с изолированными ячейками для отдельных животных. Время экспозиции для получения дозы 6 Гр составило 9 мин 24 сек.
4 - серию подвергли эмоциональному стрессу [10]. У всех животных до и после ионизирующего облучения в селезенке и лимфатических узлах тонкого кишечника определяли массу, лимфоидный индекс и количество лимфоидных клеток. Клеточные суспензии готовили из селезенки и лимфатических узлов тонкого кишечника, определяли массу подопытных животных. Осуществляли подсчет кариоцитов и определяли их жизнеспособность. Количество лимфоидных клеток в селезенке и лимфатических узлах тонкого кишечника определяли определяли по методике О.И. Белоусовой и М.И. Федотовой (1983) [11]. Определение лимфоидного индекса селезенки выполнялось по методике Е.Д. Гольдберга и соавт. (1972) [12], а в лимфатических узлах тонкого кишечника - по методу Б.А. Жетписбаева (1995) [13].
Полученные цифровые данные обрабатывались общепринятыми методами вариационной статистики по методике Е.В. Монцевичюте-Эрингене (1966) [14].
Результаты и обсуждение
Из таблицы 1 видно, что после сублетального гамма-облучения в дозе 6 Гр В лимфатических узлах тонкого кишечника отмечается достоверное снижение массы, числа лимфоидных клеток и лимфоидного индекса на 28%, 27% и 28% соответственно (P](data:image/gif;base64,R0lGODlhAQABAIAAAP///wAAACH5BAEAAAAALAAAAAABAAEAAAICRAEAOw==)