УДК 577.21
ПРОТЕОМНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ БЕЛОК-БЕЛКОВЫХ
ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ АПУРИНОВОЙ/АПИРИМИДИНОВОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ 1 ЧЕЛОВЕКА
Тарлыков П.В.1, Огрызько В.В.2
1Евразийский Национальный Университет им. Л.Н.Гумилева, Астана, Казахстан.
2Institut Gustave Roussy, Villejuif, France.
Научный руководитель – PhD, Раманкулов Е.М.
Апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза 1 человека (АРЕ1) – полифункциональный фермент, который помимо основной активности, расщепляющей ДНК с 5'-конца сайта рестрикции, обладает другими более слабо выраженными свойствами[1]. Среди них – 3'-5'-экзонуклеазная, которая проявляется более эффективно на ДНК-дуплексах, содержащих на 3'-конце праймерной цепи модифицированные или неправильно спаренные нуклеотиды. Существует предположение, что за счет своей экзонуклеазной активности АРЕ1 может служить корректором синтеза ДНК, катализируемого ДНК-полимеразой β, в ходе эксцизионной репарации оснований ДНК.
Так как белок APE1 выполняет важную функцию в репарации ДНК, он является перспективной мишенью для предотвращения выживания раковых клеток после химиотерапии. Рост данных свидетельствует о том, что несбалансированная репарация ДНК может быть одним из факторов развития рака[2]. Также APE1 имеет окислительно- восстановительные функции и способствует активации других ферментов, участвующих в репарации ДНК. Таким образом, выключение APE1 может привести к чувствительности опухолевых клеток, предотвращая выживание раковых клеток от химиотерапии [3].
В настоящей работе особенное внимание было уделено апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазе 1 с целью изучения новых механизмов репарации и эпигенетического перепрограммирования человеческого генома, так как предполагается, что помимо уже известной каталитической активности, APE1 играет важную роль в эпигенетических процессах. Изучение взаимодействия между интересующим нас белком и его партнерами является проверенным методом для выяснения функций белка. Анализ мультибелковых комплексов, очищенных напрямую из клеток дает возможность получить наиболее существенную информацию о белок-белковых взаимодействиях. С этой целью нами был очищен белковый комплекс апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 человека и с помощью масс-спектрометрии были определены индивидуальные компоненты этого комплекса.
Первым шагом в данной работе являлось получение векторной конструкции, экспрессирующей APE1. Далее проводилась котрансфекция клеток HEK293T с полученными плазмидами. Затем клетки были собраны и подвергнуты процедуре криодеструкции, что позволило максимально сохранить нативную структуру белок- белковых комплексов. Партнеры по белок-белковым взаимодействиям белка APE1 были выделены с помощью ко-иммунопреципитации (Co-IP).Очищенные комплексы анализировались посредством Gel-LC-MS/MS. В качестве отрицательного контроля та же процедура была выполнена с клетками HEK293T экспрессирующими белок GFP. Затем проводилась идентификация белков, и их отсутствие в контрольном образце подтверждалось путем мониторинга множественных реакций (Multiple Reaction Monitoring - MRM).
В итоге были идентифицированы несколько белков, которые могут быть задействованы в процессе регулирования функций APE1 в клетках.В таблице 1 представлены партнеры белок-белковых взаимодействий APE1, причем жирным шрифтом отмечены белки-компоненты SFPQ-NONO комплекса, участвующего в репарации ДНК.
Accession # Названиебелка MSscore
O75970 Multiple PDZ domain protein 20.11
P05386 60S acidic ribosomal protein P1 15.29
P06748 Nucleophosmin 64.96
P07910 Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins C1/C2 148.12 P09651 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 73.41
P09874 Poly [ADP-ribose] polymerase 1 73.93
P10809 60 kDa heat shock protein, mitochondrial 55.64
P10909 Clusterin 13.39
P22626 Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1 88.88 P23246 Splicing factor, proline- and glutamine-rich 221.92 P23588 Eukaryotic translation initiation factor 4B 161.16
P29508 Serpin B3 195.03
P31944 Caspase-14 109.73
P38159 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein G 29.58 P53999 Activated RNA polymerase II transcriptional coactivator p15 13.62 P67809 Nuclease-sensitive element-binding protein 1 21.54 Q00839 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U 60.31
Q08050 Forkhead box protein M1 25.96
Q15233 Non-POU domain-containing octamer-binding protein 188.97
Q86YZ3 Hornerin 44.99
Q8TDY2 RB1- inducible coiled-coil protein 1 13.19
Q8WXF1 Paraspeckle component 1 43.01
Q9H583 HEATrepeat-containingprotein 1 35.31
Таблица 1. Партнеры белок-белковых взаимодействий APE1 и их MSscore (Spectrum Mill score)
Таким образом, в ходе работы были охарактеризованы белковые комплексы APE1 у контрольной и экспериментальной группы клеток с использованием протеомных методов анализа. Компоненты данных комплексов идентифицированыс помощью масс спектрометрии. Дальнейшей целью является проведение биоинформатического анализа идентифицированных белков и партнеров их белок-белковых взаимодействий. Результаты данной работы в перспективе могут пролить свет на новые клеточные функции этого важного белка, а также иметь фундаментальное значение для понимания механизмов репарации и эпигенетического перепрограммирования человеческого генома.
Список использованных источников:
1. Tell, G., Quadrifoglio, F., Tiribelli, C. & Kelley, M. R. (2009) The many functions of APE1/Ref-1: not only a DNA repair enzyme, Antioxid Redox Signal. 11, 601-20.
2. Tell, G., Fantini, D. &Quadrifoglio, F. (2010) Understanding different functions of mammalian AP endonuclease (APE1) as a promising tool for cancer treatment, Cellular and Molecular Life Sciences. 67, 3589-3608.
3. Luo, M., Delaplane, S., Jiang, A., Reed, A., He, Y., Fishel, M., Nyland, R. L., II, Borch, R. F., Qiao, X., Georgiadis, M. M. & Kelley, M. R. (2008) Role of the multifunctional DNA repair and redox signaling protein Ape1/Ref-1 in cancer and endothelial cells: Small- molecule inhibition of the redox function of Ape1, Antioxidants & Redox Signaling. 10, 1853-1867.
