К.А. Жумашева, Л.Е. Муравлева, В.С. Тритек, Е.А. Калинич, О.Л. Коваленко, К. Джармухаметова, Г.О. Жузбаева
Сравнительная характеристика состояния спектра нуклеиновых кислот и перекисного окисления липидов у лиц проживающих в зоне падения и аварий
ракетоносителя "Протон"
(Карагандинский государственный университет им. Е.А. Букетова, г. Караганда) ( Карагандинская государственная медицинская академия, г. Караганда)
Одной из наиболее чувствительных и биологически важных мишеней, атакуемой свободными радикалами, является ДНК. При окислительном повреждении ДНК возможно образование различных продуктов, одним из которых является 8-оксигуанин - наиболее важный биомаркер таких повреждений. Доказано, что 8-оксигуанин обладает ошибочными коди- рующими свойствами в процессах репликации и транскрипции, что тесно связано с такими биологическими процессами как мутагенез, канцерогенез и старение. Поэтому целесообразно изучать воздействие на организм компонентов ракетного топлива, а также продуктов их распада, которое может сопровождаться нарушением обмена и функции нуклеиновых кислот.
В зарубежной литературе имеются публикации многочисленных исследований метаболизма различных производных гидразина и результатов их воздействия на жизнедеятельность как на молекулярном так и клеточном и системном уровнях. Godoy H.M. и соавторы [1, 2] пока- зали, что при метаболизме нитрозодиметиламина и монометилгидразина образуются вещества ковалентно связывающиеся с нуклеиновыми кислотами. Sagelsdorff P. и соавторы [3] обнару- жили непосредственное влияние гидразинов на ДНК клеток печени. После внутрижелудочного введения радиоактивно меченных гидразинов (диминозид, диметилгидразин, диметилнитроза- мин) их метильные группы обнаруживались в составе метильных производных ДНК. Извест- но, что метилирование генов модулирует их экспрессию. Кроме того, метаболизм производных гидразина приводит, посредством разнообразных клеточных окислительных метаболических путей, к образованию реактивных промежуточных соединений, типа свободных радикалов [4].
Одной из наиболее чувствительных и биологически важных мишеней, атакуемой свободны- ми радикалами, является ДНК. При окислительном повреждении ДНК возможно образование различных продуктов, одним из которых является 8-оксигуанин - наиболее важный биомаркер таких повреждений [5]. Доказано, что 8-оксигуанин обладает ошибочными кодирующими свой- ствами в процессах репликации и транскрипции, что тесно связано с такими биологическими процессами как мутагенез, канцерогенез и старение.
Таким образом, воздействие на организм компонентов ракетного топлива, а также продук- тов их распада, может сопровождаться нарушением обмена и функции нуклеиновых кислот.
Генотоксичность и мутагенность гидразина и его производных продемонстрированы в клеточ- ных системах in vitro [6, 7, 8] и в экспериментах на животных при однократном [9] и длительном введении [10, 11]. В рамках программы: "Мониторинг состояния здоровья и уровня дезадапта- ционных нарушений у лиц проживающих в зоне падения ракетоносителя Протон"проведены биохимические исследования плазмы крови и мочи 917 человек, проживающих в Жанаркин- ском районе, у 425 человека, проживающих в Осакаровском районе и у 639 человек, прожи- вающих в Улутауском районе. Изучались спектр нуклеиновых кислот (НК) из лейкоцитарной массы плазмы крови и показатели антиоксидантной защиты (АОЗ) и перекисного окисления липидов (ПОЛ) в плазме крови и моче. Методы исследования.
Для регистрации возможного неблагоприятного воздействия экологических условий зоны воздействия космодрома "Байконур"на состояние генетического аппарата избран метод Крит- ского Г.А. и Александрова С.В. [12]. Он заключается в модификации спектрофотометрического метода определения концентрации нуклеиновых кислот (С (мг/л крови)) в кислотном гидроли- зате лейкоцитарной массы крови человека. Помимо концентрации нуклеиновых кислот, авто- ры предложили определение параметра, характеризующего изменение формы их оптического спектра - показатель К (безразмерная величина). По данным авторов величина показателя К снижается при уровнях воздействия которые не регистрируются методом подсчета лейкоцитов и обладает, таким образом, большей чувствительностью. Определяемая в методе Критского Г.А. характеристика формы спектра нуклеиновых кислот, представляет собой величину кон-
центрации нуклеиновых кислот нормированной на оптическую плотность экстракта при длине волны 290 нм. Известно, что метилирование нуклеотидов сдвигает их максимум поглощения в длинноволновую область ультрафиолетового спектра. Кроме того, на длине волны 290 нм и близкой области имеют максимум поглощения пуриновые нуклеотиды после окислительной модификации.
Предварительно нами была проведена оценка точности используемой нами модификации этого метода и воспроизводимость его после длительного хранения кислотных экстрактов. Кро- ме того, проводился анализ правильности используемого метода в сравнении с общеизвестным спектрофотометрическим методом определения концентрации нуклеиновых кислот Спирина А.С. [13], а также контролировалось качество экстракции. Значения концентрации нуклеино- вых кислот, определяемые по методу Критского Г.А. и Александрова С.В. в среднем полностью соответствовали значениям, полученным по способу Спирина А.С.. Коэффициент корреляции между этими значениями составляет 0,83.
Для характеристики перекисного окисления липидов в плазме крови определяли концен- трацию диеновых конъюгат (ДК (нмоль/мл)) [14], образующихся на этапе инициации свобод- норадикальных процессов и малонового диальдегида (МДА (нмоль/мл)) [15], который явля- ется вторичным продуктом, свидетельствующим об окислительном распаде биомолекул. МДА определялся также в моче, разработанной нами модификацией метода реакции с 2 тиобарби- туровой кислотой. В качестве показателя антиоксидантной защиты определялась каталазная активность плазмы крови [16], обусловленная в основном действием одного из первых фермен- тов антиоксидантной защиты - каталазой.
Изучение спектра нуклеиновых кислот. Полученные данные сгруппированы по полу и месту проживания обследованных. Результаты исследований представлены в таблице 1 и рисунках 1 и 2. Как видно из представленных данных содержание нуклеиновых кислот в лейкоцитарной массе крови, как женщин, так и мужчин достаточно стабильно во всех исследованных регионах за исключением пос. Жезды где имеет место резкое снижение данного показателя.
Таблица 1 - Характеристика нуклеиновых кислот лейкоцитарной массы крови
Регион показатели Женщины Мужчины
n M±m % n M±m %
Осакаровка С
154 33,0±0,87
21 36,9±3,11
К 7,10±0,157 6,62±0,434
Жана-Арка С
206 35,5±0,76 7,4*
70 37,8±1,46 2,4
К 5,84±0,101 -
17,7*
5,59±0,134 - 15,5*
Улытау С
141 33,0±0,96 -
0,2 57 39,7±1,65 7,6
К 7,19±0,089 1,2 7,20±0,164 8,7
Жезды С
175 26,0±0,88 -
21,3* 87 28,8±1,45 -
22,0*
К 6,19±0,098 -
12,9*
6,47±0,135 - 2,3
* — различие значимо по tкритерию Стьюдента (p<0.05)
Показатель К достоверно снижен у жителей Жана-Арки и у женщин проживающих в Жез- ды. Снижение показателя у мужчин этого поселка не достигает статистически значимого уров- ня в связи с высокой вариабельностью показателя у мужчин из контрольного региона.
Рис 1 - Содержание нуклеиновых кислот (НК) в лейкоцитарной массе крови
Рис 2 - Величина показателя К - характеристики спектра нуклеиновых кислот
Снижение показателя К определяется относительным увеличением содержания в составе нуклеиновых кислот модифицированных нуклеотидов. Существенное изменение содержания таких продуктов у взрослых людей является отражением двух процессов - усиления моди- фицирующей активности различных агентов и ослабления репаративных систем. В качестве модифицирующих агентов могут выступать естественные регуляторы активности генов либо различные повреждающие агенты. В любом случае их воздействие на нуклеиновые кислоты сопровождают патологические состояния и являются следствием воздействия внешних (ради- ация, токсические вещества, мутагены окружающей среды и др.) факторов.
Изменения содержания нуклеиновых кислот и их спектра позволяет высказать предположе- ние о вероятном окислительном повреждении хроматина, что обусловливает изменения функ- ционального статуса лейкоцитов, и определяет снижение неспецифической резистентности ор- ганизма к действию неблагоприятных факторов окружающей среды и, кроме того, является отражением системного дефицита механизмов детоксикации и репарации.
Функциональное состояние систем перекисного окисления липидов и антиокислительной защиты. Группировка наблюдений была аналогична описанной выше. Результаты исследова- ний представлены в таблице 2 и рисунках 3 6.
Рис. 3 - Каталазная активность плазмы крови
Таблица 2 - Характеристика показателей АОЗ и ПОЛ плазмы крови и мочи
Регион показатели Женщины Мужчины
n M±m % n M±m %
Осакаровка
Кат. акт. 276 0,584±0,0217 57 0,533±0,049
ДК 279 27,6±0,89 66 24,5±1,65
МДА пл. 274 2,93±0,071 58 2,86±0,139
мочи 305 5,44±0,170 72 5,84±0,356
Жана-Арка
Кат. акт. 509 0,479±0,0154 -
17,9*
231 0,520±0,028 -2,4
ДК 578 22,9±0,45 -
17,2*
253 24,4±0,69 -0,1
МДА пл. 570 3,70±0,077 26,4* 254 3,66±0,101 27,8*
мочи 513 2,50±0,099 -
54,0*
240 2,75±0,142 -
52,9*
Улытау
Кат. акт. 137 0,774±0,0292 32,6* 58 0,738±0,036 38,6*
ДК 108 21,2±1,13 -
23,3*
50 23,9±1,59 -2,3
МДА пл. 140 2,91±0,139 -0,7 60 2,84±0,192 -0,9
мочи 141 3,59±0,203 -
33,9*
58 5,15±0,397 -11,9
Жезды
Кат. акт. 216 0,889±0,0226 52,4* 107 0,872±0,029 63,7*
ДК 192 26,1±1,12 -5,6 89 27,6±1,51 13,0
МДА пл. 221 3,29±0,059 12,5* 114 3,38±0,089 18,2*
мочи 242 4,23±0,194 -
22,1*
117 5,08±0,294 -
13,0*
* — различие значимо по tкритерию Стьюдента (p<0.05)
Рис. 4 - Содержание диеновых конъюгат (ДК) в плазме крови
Рис. 5 - Содержание малонового диальдегида (МДА) в плазме крови
Рис. 6 - Содержание малонового диальдегида (МДА) в моче
При рассмотрении представленных выше данных необходимо помнить, что подавляющее число обследованных в контрольном регионе по данным терапевтического исследования име- ют те или иные заболевания, а ПОЛ, являясь компонентом нормального метаболизма, чутко изменяется в ответ практически на любые воздействия. Так высокое содержание ДК в кро- ви жителей Осакаровки это отнюдь не норма, однако, в сочетании с низкой концентрацией в крови токсичных вторичных продуктов (МДА), которые эффективно удаляются из организ- ма с мочой, и низкой каталазной активностью, можно говорить о контролируемом течении свободнорадикальных процессов.
При анализе полученных данных у жителей Осакаровки выявляются определенные кор- реляционные связи между исследуемыми показателями, которые вполне объяснимы. Уровень концентрации диеновых конъюгат прямо связан с концентрацией малонового диальдегида - ко- эффициент корреляции Пирсона (r) равен 0,21 (p=0.018). Концентрации диеновых конъюгат и малонового диальдегида, в свою очередь, связаны с уровнем каталазной активности плазмы с коэффициентами корреляции равными 0,29 и 0,28 соответственно (p<0.002). А характеристика К нуклеиновых кислот лейкоцитов негативно связана с каталазной активностью плазмы r= 0,35 (p<0.001) и несколько слабее с показателями ПОЛ. Наличие этих связей демонстрирует есте- ственность развития процессов ПОЛ у жителей Осакаровки и подтверждает предположение о прямой зависимости интенсивности процессов липопероксидации и повреждения нуклеиновых кислот.
У обследованных жителей Жана-Арки и Улытау выраженность этих связей значимо сни- жена до величин близких к нулю. Либо, как у жителей Жезды, извращена - корреляцион- ная связь между каталазной активностью плазмы крови и концентрацией диеновых конъюгат оказалась равной -0,26 (p=0.002), что свидетельствует о некомпенсированном (на уровне ка- талазы) течении ПОЛ. Только у жителей Жана-Арки сохраняется единственная связь между показателем К и диеновыми конъюгатами r= 0,17 (p=0.014). Разрушение корреляционных свя- зей, вероятно, отражает глубокие нарушения в естественных процессах регуляции и контроля исследуемых процессов. Следствием этих нарушений являются накопление в крови жителей Жана Арки и Жезды малонового диальдегида, которое не компенсируется его экскрецией с мочой. Представленные выше результаты биохимических исследований не могут не насто- раживать, ибо свидетельствуют о значимых изменениях в состоянии генетического аппарата быстро пролиферирующих клеток крови, которые являются отражением системных негатив- ных процессов вследствие влияния неблагоприятных условий проживания. Очевидно, что по результатам данного исследования невозможно установить причинно следственную связь меж- ду влиянием космодрома и обнаруженными изменениями, но и отрицать ее существование на наш взгляд нельзя.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Godoy HM, Diaz Gomez MI, Castro JA. Metabolism and activation of 1,1-dimethylhydrazine and methylhydrazine, two products of nitrosodimethylamine reductive biotransformation, in rats. J Natl Cancer Inst 1983 Nov.
2. Godoy HM, Diaz Gomez MI, Castro JA. Metabolism and activation of 1,1-dimethylhydrazine and methylhydrazine, two products of N-nitrosodimethylamine reductive biotransformation. IARC Sci Publ 1984.
3. Sagelsdorff P, Lutz WK, Schlatter C. DNA methylation in rat liver by daminozide, 1,1- dimethylhydrazine, and dimethylnitrosamine. Fundam Appl Toxicol 1988 Nov.
4. Tomasi A, Albano E, Botti B, Vannini V. Detection of free radical intermediates in the oxidative metabolism of carcinogenic hydrazine derivatives. Toxicol Pathol 1987
5. Брусков В.И., Масалимов Ж.К., Усачева А.М. Определение 8 оксигуанина в ДНК методом хемилюминесцентного иммуноферментного анализа. Биохимия, 1999, Т. 64, вып. 7, С. 958 964.
6. Beije B, Onfelt A, Olsson U. Influence of dietary selenium on the mutagenic activity of perfusate and bile from rat liver, perfused with 1,1-dimethylhydrazine. Mutat Res 1984 Apr.
7. Beije B, Olsson U, Onfelt A. Effect of dietary selenium on biotransformation and excretion of mutagenic metabolites of N-nitrosodimethylamine and 1,1-dimethylhydrazine in the liver perfusion/cell culture system. IARC Sci Publ 1987
8. Rogers AM, Back KC. Comparative mutagenicity of hydrazine and 3 methylated derivatives in L5178Y mouse lymphoma cells. Mutat Res 1981 Aug
9. Sasaki YF, Saga A, Akasaka M, Ishibashi S, Yoshida K, Su YQ, Matsusaka N, Tsuda S.
Organ-specific genotoxicity of the potent rodent colon carcinogen 1,2-dimethylhydrazine and three hydrazine derivatives: difference between intraperitoneal and oral administration. Mutat Res 1998 Jul 8.
10. Tamura T, Shibutani M, Toyoda K, Shoda T, Takada K, Uneyama C, Takahashi M, Hirose M.
Tumor-promoting activities of hydroquinone and 1,1-dimethylhydrazine after initiation of newborn mice with 1-methyl-1-nitrosourea. Cancer Lett 1999 Aug 23
11. Ernst H, Rittinghausen S, Wahnschaffe U, Mohr U. Induction of malignant peripheral nerve sheath tumors in European hamsters with 1,1-dimethylhydrazine (UDMH). Cancer Lett 1987 Jun 12. Г. А. Критский, С. В. Александров. Диагностика радиационного поражения по анализу нуклеиновых кислот крови. Биохимические методы. М.: Наука, 1980.- С. 118-121.
13. Спирин А.С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот // Биохимия, 1958,- Т. 23, вып. 5,- С.656-662.
14. Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И. Спектрофотометрическое определение содержания гидроперекисей липидов в плазме крови // Лаб. дело, 1983, № 3.- С. 33-35.
15. Коробейникова Э.Н. Модификация определения продуктов перекисного окисления липидов в реакции с тиобарбитуровой кислотой // Лаб. дело - 1989.- № 7.- С. 8-10.
16. Aebi H., Suter H., Feinstein R. N. Activity and stability catalase in blood and tissues of normal and acatalasemic mice. Biochem. Genet. - 1968. Vol. 2. - P. 245 257.
Жумашева К.А., Муравлева Л.Е., Тритек В.С., Калинич Е.А., Коваленко О.Л., Джармухаметова К., Жузбаева Г.О.
«Протон »ракетатасымалдауыш апатқа ұшырап, құлаған аймақта тұратын адамдардағы нуклеин қы- шқылдардың және липидтердiң тотығу спектр жағдайының салыстырмалы мiнездемесi
Бос радикалдардың шабуылына ұшырайтын сезiмтал және биологиялық маңызды мишеньнiң бiрi ДНК болып сана- лады. ДНҚ қышқылының бұзылуы кезiнде түрлi заттар түзiледi , ең маңызды биомаркердiң бiрi 8-оксигуанин. Репли- кация және транскрипция процесстерiнде 8-оксигуанин қате кодтайтындығы дәлелденген, және сол құбылыс мутагенез, канцерогенез және қартаю сияқты биологиялық процесстермен тығыз байланысты. Алмасу және нуклеин қышқылдары- ның функцияларының бұзылуы арқылы ағзаға ракетаның жанармайы әсер ететiндiгiн зерттеуге болады.
Zhumasheva K.A., Muravleva L.E., Tritek V.S., Kalinich E.A., Kovalenko O.L., Dzharmuhametova K., Zhuzbaeva G.O.
Comparative characterization of the state of the spectrum of nucleic acids and lipid peroxidation in persons living in the area of incidence of accidents and rocket «Proton»
One of the most sensitive and biologically important targets, attacked by free radicals, is DNA. At oxidative damage of DNA probably formation of the various products one of which is 8- oxy guanine - the most important biomarker of such damages. It is proved that 8-oxyguanine possesses erroneous coding properties in processes replications and transcriptions that are closely bound to such biological processes as a mutagenesis, a carcinogenesis and ageing. Therefore it is expedient to study influence on an organism of components of rocket fuel, and also products of their disintegration which can be accompanied by disturbance of an exchange and function of nucleic acids.
Поступила в редакцию 12.05.10 Рекомендована к печати 31.05.10
