ҚАЗАҚСТАН РЕСПУБЛИКАСЫ БІЛІМ ЖӘНЕ ҒЫЛЫМ МИНИСТРЛІГІ Л.Н. ГУМИЛЕВ АТЫНДАҒЫ ЕУРАЗИЯ ҰЛТТЫҚ УНИВЕРСИТЕТІ
Студенттер мен жас ғалымдардың
«Ғылым және білім - 2014»
атты IX Халықаралық ғылыми конференциясының БАЯНДАМАЛАР ЖИНАҒЫ
СБОРНИК МАТЕРИАЛОВ
IX Международной научной конференции студентов и молодых ученых
«Наука и образование - 2014»
PROCEEDINGS
of the IX International Scientific Conference for students and young scholars
«Science and education - 2014»
2014 жыл 11 сәуір
Астана
УДК 001(063) ББК 72
Ғ 96
Ғ 96
«Ғылым және білім – 2014» атты студенттер мен жас ғалымдардың ІХ Халықаралық ғылыми конференциясы = ІХ Международная научная конференция студентов и молодых ученых «Наука и образование - 2014» = The IX International Scientific Conference for students and young scholars «Science and education - 2014».
– Астана: http://www.enu.kz/ru/nauka/nauka-i-obrazovanie/, 2014. – 5830 стр.
(қазақша, орысша, ағылшынша).
ISBN 978-9965-31-610-4
Жинаққа студенттердің, магистранттардың, докторанттардың және жас ғалымдардың жаратылыстану-техникалық және гуманитарлық ғылымдардың өзекті мәселелері бойынша баяндамалары енгізілген.
The proceedings are the papers of students, undergraduates, doctoral students and young researchers on topical issues of natural and technical sciences and humanities.
В сборник вошли доклады студентов, магистрантов, докторантов и молодых ученых по актуальным вопросам естественно-технических и гуманитарных наук.
УДК 001(063) ББК 72
ISBN 978-9965-31-610-4 © Л.Н. Гумилев атындағы Еуразия ұлттық
университеті, 2014
3636 гроздья винограда.
При дифференцировке клетки всех тканей изменялись морфологически и фенотипически. Визуально проследить и оценить динамическую морфологию в культурах было проще при дифференцировке в адипогенную линию, так как клетки начинали накапливать жировые включения. Остеогенную дифференцировку проследить было сложнее.
Было отмечено постепенное изменение морфологических особенностей клеток всех культур.
Клетки в динамике приобретали более округлую форму, внутри клеток образовывались характерные специфические отложения.
Список использованных источников
1. Le Blanc K, Frassoni F, Ball L, Locatelli F, Roelofs H, Lewis I, Lanino E, Sundberg B, Bernardo ME, Remberger M et al: Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant, severe, acute graft-versus-host disease: a phrase II study. The Lancet, 371 (9624): 1579 - 1586.
2. Patel AN, Geffner L, Vina RF, Saslavsky J, Urschel Jr HC, Kormos R, Benetti F: Surgical treatment for congestive heart failure with autologous adult stem cell transplantation: A prospective randomized study. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery 2005, 130 (6): 1631 – 1638.e 1632.
3. Aldahmash A, Zaher W, Al-Nbaheen M, Kassem M: Human stromal (mesenchymal) stem cells:
basic biology and current clinical use for tissue regeneration. Ann Saudi Med 2012, 32 (1): 66 – 77.
4. BECKER AJ, McCULLOCH EA, TILL JE: Cytological demonstration of the clonal nature of spleen colonies derived from transplanted mouse marrow cells. Nature 1963, 197:452 – 454.
5. Chateauvieux S, Ichante JL, Delorme B, Frouin V, Pietu G, Langonne A, Gallay N, Sensebe L, Martin MT, Moore KA et al: Molecular profile of mouse stromal mesenchymal stem cells. Physiol Genomics 2007, 29 (2): 128 – 138.
6. Шахов В. П., Попов С. В. Стволовые клетки и кардиомиогенез в норме и патологии. – Томск: STT, 2004.- 170 с.
УДК 579.61:616-078
БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К АНТИБИОТИКАМ БИОПЛЕНКООБРАЗУЮЩИХ ШТАММОВ
S. EPIDERMIDIS
Ольга Игоревна Сидашенко1, Ольга Сергеевна Воронкова2, Елена Альбертовна Сирокваша3, Татьяна Николаевна Шевченко4, 5Альберт Иванович Винников
1Аспирант, ведущий инженер НИИ биологии Днепропетровского национального университета им. О. Гончара, 2к.б.н., доцент кафедры микробиологии, вирусологии и биотехнологии ДНУ им. О. Гончара, 3к.м.н., доцент кафедры клинической диагностики ДНУ
им. О. Гончара, 4д.б.н., профессор кафедры клинической диагностики, Днепропетровск, Украина. 5
Научный руководитель – А. Винников.
На современном этапе в медицинской микробиологии происходят качественные изменения в интерпретации процессов, происходящих при хронических инфекциях.
Исследования механизмов развития инфекционного процесса, включая образование персистирующих форм микроорганизмов, должны учитывать наличия особого биологического явления – формирования бактериальных биопленок [2].
Биопленки – это подвижные, непрерывно изменяющиеся ассоциации микроорганизмов, в составе которых бактерии локализованы на биогенной или абиогенной поверхности внутри сложноорганизованного внеклеточного матрикса, имеющего белковую либо полисахаридную природу. Экзополимерный матрикс выполняет роль пленочного барьера и защищает
3637 микроорганизмы от внешних воздействий [1].
Бактериальная биопленка образуется в результате сложных координированных взаимодействий микроорганизмов с поверхностью и ее формирование состоит из следующих этапов: начальное прикрепление к поверхности, образование монослоя, движение по поверхности с образованием микроколоний, созревание биопленки и формирование трехмерной структуры [9].
Способность бактерий существовать в виде биопленок создает большие проблемы в медицинской практике. По данным разных авторов, не менее 60% инфекций вызывается возбудителями, локализованными в биопленках. В этой связи наибольшее внимание исследователей привлекает устойчивость биопленок к антибактериальным препаратам и факторам иммунной защиты макроорганизма. Огромной проблемой современной медицины является способность микроорганизмов в инфицированном макроорганизме, а также на поверхности различных приборов, имеющих медицинское назначение – катетеров, глазных линз, искусственных клапанов сердца и т.д., формировать биопленки, вызывая при этом осложнения и хронизацию инфекционного процесса. Одними из самых известных бактерий, способных к формированию биопленок являются стафилококки, в особенности эпидермиальные. При этом S. epidermidis входит в состав нормальной микрофлоры макроорганизма и характеризуется выоским уровнем вирулентности.
Есть данные [13], о том, что микроорганизмы, входящие в состав биопленок, в отличии от планктонных культур, в 100 – 1000 раз менее чувствительны к большинству антибиотиков, а также более устойчивы к неблагоприятным воздействиям окружающей среды, таким как изменение температуры, рН среды, осмотического давления.
Природе этой устойчивости посвящено много работ. Наибольшее распространение получили представления о том, что значительную роль в приобретаемой устойчивости играет способность экзополисахаридного матрикса связывать антибиотики, а также существенный вклад в устойчивость вносит наличие генов устойчивости и обмен ими у микроорганизмов.
Таким образом, изучение влияния антибиотиков на развитие биопленки патогенными и условно-патогенными микроорганизмами, являются необходимыми условиями понимания, как биологических основ формирования биопленки, так и поиска препаратов, эффективно подавляющих пленкообразующие бактерии, вызывающие инфекционные осложнения.
Поэтому крайне необходимым является изучение биологических свойств пленкообразующих штаммов и влияния антибиотиков на развитие и структуру биопленок с целью выбора антибактериальных препаратов, способных к подавлению их возникновения с одной стороны и деструкция уже сформированной биопленки с другой.
Цель работы – изучить биологические свойства и определить чувствительность к антибиотикам биопленкообразующих штаммов S. epidermidis в планктонной культуре.
Материалы и методы. Всего было исследовано 122 клинических штамма стафилококков, которые были выделены из влагалища 67 женщин, поверхности кожи, ран и носоглотки 89 человек. Из них отбирали штаммы, которые принадлежат к виду S. epidermidis.
Идентификацию штаммов стафилококков проводили в соответствии с признаками, приведенных в Определителе Берджи: рост на солевом агаре (содержание NaCl 10%), ферментирование глюкозы, лактозы, чувствительность к новобиоцину (МПК < 1,6 мкг/мл), отсутствие коагулазы, восстановление нитратов, отсутствие образования кислоты из маннита при анаэробном культивировании, образование кислоты в аэробных условиях из сахарозы и мальтозы и т.д. Дифференциацию стафилококков на коагулазоположительные и коагулазоотрицательные проводили с использованием сухой цитратной плазмы кролика в реакции плазмокоагуляции (ЗАО «Биолик», Украина).
Изучение способности к пленкообразованию проводили визуально с помощью модифицированной методики: в лунки стерильного иммунологического планшета вносили 0,2 мл мясо-пептонного бульона (МПБ), засевали 0,1 мл суспензии, содержащей 1 × 106 клеток/мл суточной культуры штамма S. epidermidis. За пленкообразованием наблюдали на протяжении 72 часов. По окончании инкубации остатки среды удаляли при помощи
3638
микропипетки. Оставшаяся на стенках луночки пленка была свидетельством способности штамма к пленкообразованию [9].
У исследуемых штаммов проводили изучение гемолитической на кровяном агаре, липазной и лецитиназной активностей на желточно-солевом агаре [6]. Способность исследуемых штаммов к адгезии изучали на клетках буккального эпителию развернутым методом [3].
Следующим этапом было изучение чувствительности к антибиотикам методом дисков [6]. Для этого из суточной культуры готовили суспензию (1 × 106 клеток/мл), которую засевали по 0,1 мл на чашки Петри с МПА. В каждую чашку помещали не более 6 дисков с антибиотиками. Использовали диски таких антибиотиков: цефтриаксон, цефуроксим, цефтазидим, тетрациклин, доксициклина гидрохлорид, сизомицин, пенициллин, олеандомицин, оксациллин, азтреонам, гентамицин, эритромицин (диски производства Himedia Laboratories Prv. Limited, Индия), ципрофлоксацин, офлоксацин, налидиксовая кислота, пипемидиновая кислота, норфлоксацин, левофлоксацин, спарфлоксацин (ТОВ
«Аспект», РФ).
После определения антибиотиков, к которым чувствительны изучаемые штаммы, определяли МПК этих антибиотиков методом серийных разведений. Через 24 часа проводили учет результатов. Для определения наличия роста микроорганизмов пробирки с посевами просматривали в проходящем свете.
Эксперименты проводили в пяти повторностях. Статистическая обработка полученных результатов проводилась по стандартной методике с использованием критерия Стъюдента.
Результаты. Из полученных 122 штаммов стафилококков к коагулазоположительным относится 67, а к коагулазоотрицательным – 55. После проведения идентификации коагулазонегативных стафилококков, среди которых 37 штаммов были идентифицированы как S. epidermidis. Из них к биопленкообразованию способны 20 штаммов. Биопленка образовывалась на дне и стенках лунок иммунологического планшета.
При изучении факторов патогенности оказалось, что гемолиз, который характеризовался полным просветлением (средний показатель ширины зоны 18±0,3 мм) на кровяном агаре и липазнаю (средний показатель ширины зоны 5±0,3 мм) активность на желточно-солевом гаре проявляли все пленкообразующие штаммы S. epidermidis.
лецитиназную активность наблюдали у 80% пленкообразующих штаммов.
Определено, что все биопленкообразующие штаммы способны адгезироваться к клеткам буккального эпителия человека. Все 20 биопленкообразующих штаммов S. epidermidis оказались высоадгезивными, так как среди штаммов, способных образовывать биопленку, самый высокий ИАМ составлял 11,84, а самый низкий – 4,68. Определено, что 1 штамм имел ИАМ, что составлял 4,68, ИАМ от 7,64 до 7,93 имели 2 штамма, ИАМ от 8,1 до 9,45 – 5 штаммов, ИАМ, что составлял от 9,8 до 10,03 – 3 штамма, ИАМ выше за11,09 – 5 штаммов.
Изучение устойчивости к антибиотикам показало, что фторхинолоны второго и третьего поколений (офлоксацин и левофлоксацин) были эффективны против всех 20 биопленкообразующих штаммов S. epidermidis. К ципрофлоксацину проявили чувствительность 70% штаммов, к норфлоксаицну – 80%, к спарфлоксаицну – 85%. Все пленкообразующие штаммы были устойчивыми к налидиксовой и пипемидиновой кислотам.
В отличие от фторхинолонов, к тетрациклину среди 20 изучаемых штаммов устойчивость проявили 40% штаммов, а к доксициклин гидрохлориду – 35%. При использовании дисков с сизомицином резистентными оказались 50% штаммов, а к гентамицину – 15% штамма.
Влияние цефалоспоринов на пленкообразующие штаммы S. epidermidis исследовали на примере цефтриаксона, цефуроксима та цефтазидима. К цефтриаксону устойчивость проявили 20% исследуемых штамма, к цефуроксиму – 60%, к цефтазидиму – 55% штаммов.
К азтреонаму (антибиотик клааса монобактамов ) устойчивость проявили 60%
штаммов.
3639
Большинство исследуемых штаммов оказались устойчивы к эритромицину – 70%
штаммов, пенициллину – 85% штаммов, оксациллину – 75% штаммов, олеандомицину – 80%
штаммов.
Таким образом, среди антибиотиков, которые угнетают рост пленкообразующих штаммов, наиболле активними оказались фторхинолоны, мишенью действия которых выступают ДНК-гираза и топоизомераза, тетрациклины и аминогликозиды, которые ингибируют синтез белка, связываясь с 30S-субъединицей бактериальной рибосомы. Мало эффективными оказались антибиотики класса β-лактамов и ряда макролидов. Известно, что микроорганизмы, которые входять в состав биопленок имеют дополнительные гены и являются носителями плазмид, что делают их болем устойчивыми к большинству антибиотиков. Поэтому, можно предположить наличие у изучаемых штаммов соответствующих плазмидных или хромосомних детерминант устойчивости к названным антибиотикам.
Полученные нами данные в целом совпадают с данными литературы. Так, в работах разных авторов [4, 5, 7], к ципрофлоксацину чувствительность проявляли 100%
биопленкообразующих штаммов S. еpidermidis. К гентамицину чувствительность варьировала от 35,7 до 100% штаммов, что совпадает с данными полученными нами – 100%
и 85 % соответственно. К эритромицину в различных исследованиях было показано разную чувствительность: от 46,4 до 78,3 %. В наших исследованиях наоборот, установлено более низкий показатель: лишь 30% штаммов были чувствительны. К антибиотикам класса цефалоспоринов чувствительность проявляли от 20 до 70 % штаммов [4, 5], что подтверждается и в наших исследованиях: чувствительность проявляли 35-60 % штаммов в зависимости от антибиотика. По данным литературы высокой процент устойчивых штаммов наблюдали к β-ιΰθοΰκλϋκ ΰλοζαζμοζθΰκ – ρζβξοβζοειόλϋπ ςοΰκκμβ νμ Ҕΰελϋκ δΰλλϋκ μο 10-40 ΰλοζαζμοζθμβ.
S. epidermidis, были отобраны наиболее эффективные препараты – офлоксацин, левофлоксацин, доксициклин гидрохлорид, цефтриаксон и гентамицин.
В результате проведенных исследований определено, что самая низкая МПК офлоксацина для планктонной культуры составляла 0,15 мкг/мл, а самая высокая – 3,0 мкг/мл. При этом средняя МПК для планктонных культур биопленкообразующих штаммов S. epidermidis составляла 0,48±0,6 мкг/мл. Самая низкая МПК левофлоксацина – 0,3 мкг/мл, а самая высокая – 1,5 мкг/мл, среднее значение МПК даного антибиотика – 0,7±0,29 мкг/мл.
Средняя МПК доксициклин гидрохлорида, что угнетает рост планктонных культур пленкообразующих штаммов S. epidermidis составляла 1,2±0,44 мкг/мл, при этом самая низкая МПК – 0,5 мкг/мл, а самая высокая – 2,0 мкг/мл.
Определено, что самая низкая МПК цефтриаксона для изучаемых штаммов – 8,0 мкг/мл, а самая высокая – 15 мкг/мл. Средняя МПК цефтриаксона 10,87±1,99 мкг/мл.
Самая низкая МПК гентамицина составляла 4,0 мкг/мл, а самая высокая – 15,0 мкг/мл, а среднее значение МПК гентамицина равняется 8,1±3,2 мкг/мл.
По данным литературы угнетение формирования биопленки бактериями происходило при использовании концентрации фторхинолонов, превышающих их МПК в 5,0 раз, а по другим данным – даже в 50-100 раз по сравнению с планктонными формами [10, 11]. По результатам наших исследований максимально МПК фторхинолонов для планктонных и биопленочных культур отличались в 5,0 раз.
В условиях тесного контакта между клетками внутри биопленки показана возможность передачи генов устойчивости к ванкомицину и тетрациклину от E. faecium к S. aureus. По результатам исследований других авторов, МПК доксициклина для биопленки может превышать МПК для планктона в 50 раз. МПК цефалоспоринов для планктонных и биопленочных культур отличались в 100 раз [11]. В результате наших исследований установлено незначительные различия между МПК доксициклина и МПК цефтриаксона для
3640
планктона и биопленки: МПК исследуемых антибиотиков для биопленки превышали в 3,0 раза МПК для планктона.
Показано, что отрицательно заряженные экзополисахариды достаточно эффективно защищают клетки биопленки от гидрофильных и положительно заряженных антибиотиков, например аминогликозидов. По данным литературы МПК антибиотиков из класса аминогликозидов для планктонных культур бактерий в 15 раз меньше МПК для биопленки [12]. По результатам наших исследований МПК гентамицина для планктонных и биопленочных культур отличались в 4,0 раза.
Таким образом, можно предположить, что высокий уровень гемолитической, липазной и лецитиназной активностей биопленкообразующих штаммов S. epidermidis позволяет противостоять и угнетать защитные иммунные механизмы макроорганизма с одной стороны, а интенсивная адгезия, которая обусловлена высоким адгезивным потенциалом – с другой, приводит к активной колонизации пораженных и интактных органов, а также повышенная устойчивость к антибиотикам создает этим микроорганизмам условия для долгого персистирования в организме и приводит к хронизации инфекционных процессов.
Список использованных источников
1. Афиногенова А.Г., Даровская Е.Н. Микробные биопленки ран: состояние вопроса //
Травмотология и ортопедия России, Т. 61, ғ3, 2011, С. 119-125.
2. Гостев В.В., Сидоренко С.В. Бактериальные биопленки и инфекции // Журнал инфектологии, Т2, ғ3, 2010, С. 4-15.
3. Коваленко Н.К., Ливинская Е.П., Полтавская О.А., Гармашева И.Л., Шинкаренок Л.Н., Олещенко Л.Т. Пробиотические свойства промышленных штаммов лактобацилл и бифидобактерий // Микробиологический журнал, Т. 72, ғ 1, 2010, С. 9-17.
4. Коленчукова О.А. Проблема приобретения устойчивости к антибиотикам популяции штаммов Staphylococcus epidermidis в зависимости от техногенной нагрузки // Антибиотики и химиотерапия, Т. 52, ғ9, 2007, С. 41-44.
5. Коленчукова О.А., Савченко А.А. Дозозависимое влияние пенициллина на активность метаболических ферментов штаммов Staphylococcus epidermidis // Антибиотики и химиотерапия, Т. 50, ғ 4, 2005, С. 3-6.
6. Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений: приказ ғ 535 от 22.04.1985р. – М.: МОЗ СССР, 1985. – С. 65.
7. Скоробогатых Ю.И., Перунова Н.Б., Курлаева П.П., Бухарин О.В. Экспериментальное изучение комбинации ципрофлоксацина с окситоцином на образование биопленок условно- патогенными бактериями // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, ғ6, 2010, С. 3-7.
8. Смирнова Т. А., Диденко Л. В., Азизбекян Р. Р., Романова Ю. М. Структурно- функциональная характеристика бактериальных биопленок // Микробиология, Т. 79, ғ4, 2010, С. 435—446.
9. Смирнова Т.А., Диденко Л.В., Романова Р.Р. Структурно-функциональная характеристика бактериальных биопленок // Микробиология, Т. 79, ғ4, 2010, С. 435-446.
10. Тец В.В. Микроорганизмы и антибиотики. Инфекции кожи, мягких тканей, костей и суставов. СПб.: КЛЕ-Т. – 2006. – С. 128.
11. Чернявский В. И. Бактериальные биопленки и инфекции (лекции). // Аннали мечниковского института, ғ 1, 2013, С. 86-90.
12. Hatch, R. A., and N. L. Schiller. Alginate lyase promotes diffusion of aminoglycosides through the extracellular polysaccharide of mucoid Pseudomonas aeruginosa // Antimicrob. Agents Chemother. 1998 ғ 42. Р. 974-977.
13. Lewis K. Persister cells and the riddle of biofilm survival. Biochemistry. 2005. ғ2 (70).
Р. 327–336.
