УДК 577.21; 577.15; 575.224.4
ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА РЕПАРАЦИИ ДНК hNEIL1 Бердыкенов А.М.
РГП «Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан» КН МОН РК, Астана, РК. [email protected]
Научный руководитель - к.х.н., Хасенов Б.Б.
Основной функцией ДНК, как известно, является сохранение наследственной информации путем полуконсервативной репликации. Матричный синтез, происходящий при репликации и транскрипции, следует правилам комплементарности азотистых оснований (А-Т и Г-Ц), основанным на их особой химической структуре, позволяющей ферментам этих синтезов, ДНК- и РНК-полимеразам, точно копировать последовательность нуклеотидов. Большинство этих ферментов строго различают нормальные звенья в матричных молекулах, поэтому, как правило, химические модификации нуклеотидов в ДНК приводят к блоку нормальной транскрипции и репликации, то есть являются некодирующими повреждениями. К таковым относятся внутритяжевые сшивки пиримидиновых нуклеотидов (циклобутановыедимеры и 6-4 фотопродукты), образующиеся после УФ облучения, межтяжевые сшивки по пуриновым нуклеотидам, разнообразные ковалентные аддукты оснований, образуемые некоторыми химическими канцерогенами, тиминовые гликоли, апуриновые и апиримидиновые сайты и т.п. В редких случаях химические модификации нуклеотидов сохраняют способность к комплементарному спариванию во время репликации и транскрипции, однако это спаривание происходит неоднозначно.
Стартовыми ферментами при репарации поврежденных оснований выступают ДНК- гликозилазы, которые осуществляют удаление поврежденных оснований порядка 20 тысяч раз в сутки в каждой клетке человеческого организма. На сегодняшний момент известно 11 человеческих генов, кодирующих ДНК-гликозилазы, которые распознают свой, индивидуальный набор повреждений. Все они являются объектами изучения молекулярной биологии и медицины, так как именно с ними связывают перспективы лечения ряда хронических заболеваний.
Среди наиболее изучаемых ДНК гликозилаз, на данный момент, является NEIL1 впервые описанный в 2002 году. Белок NEIL1 относится к семейству FPG белков. Данный белок вовлечен в репарацию поврежденных оснований ДНК, вызванных окислительным стрессом и мутагенными агентами. Действует как ДНК гликозилаза, которая распознает и удаляет поврежденные основания. Имеет предпочтения к окисленным пиримидинам, таким как тимин гликоль, формамидопиримидин и 5-гидроксиурацил. Имеются противоречивые данные относительно гликозидазной активности в отношении 8- оксогуанина. Имеется АР-лиазнаяактивность проявляемая в разрезе ДНК нити, содержащей апурино/апиримидиновый сайт. Имеется гликозилазно-лиазная активность в репарированиинекомплементарных оснований с участием урацила и тимина (U:C и T:C ошибки).
Данный белок локализован в ядре, сильно зависит от клеточного цикла и транслируется в S-фазе. Кодируется геном neil1, который локализован на 15 хромосоме и имеет размер 8,163 оснований (52,397,780 bp - 52,405,942 bp от pter).
Общая длина белка – 390 аминокислотных остатков, масса – 43,684 кДа. В литературе описаны две изоформы аминокислотной последовательности белка NEIL1, образуемые альтернативнымсплайсингом.
Ввиду недостаточной изученности фермента NEIL1 и сложности исследования его активности в условиях invivo имеет смысл получения его рекомбинантной формы для изучения репарационной активности в условиях invitro.
Целью данной работы является получение рекомбинантного гетерологичного белка NEIL1 путем плазмидной экспрессии гена в культуре Escherichiacoli.
Плазмидный вектор phNEIL1 был взят из коллекции лаборатории молекулярной генетики растений Национального центра биотехнологии Республики Казахстан. В составе данной конструкции ген neil1 интегрирован в экспрессионный вектор pET-22b(+) по сайтам NdeI и XhoI. Из литературных источников известно, что дополнительный пептид с С-конца может ухудшить ферментативную активность данного белка, поэтому для устранения гексамернойгистидиновой метки, входящей в состав вектора pET-22b(+) в конце гена вставленстоп-кодон. Ген neil1 встроен под контроль промотора РНК- полимеразы бактериофага T7. Полученным вектором phNEIL1 трансформировали клетки штамма E. coliRosetta(DE3)pLysS, содержащие ген РНК полимеразы Т7 под контролем промотора lacUV5. Отбор трансформантов проводили на твердой питательной среде Луреа-Бертани с антибиотиком ампициллином. Единичные колонии трансформантов культивировали в жидкомбульоне Луреа-Бертани с ампициллином. Индукцию гетерологичного белка проводили по достижении середины логарифмической фазы роста добавлением изопропил-β-D-1-галактопиранозида в концентрации 0,2 мМ. Результаты индукции проверили методом белковогоэлектрофрезализата в полиакриламидном геле в денатрурирующих условиях (рисунок).
Рисунок. Результаты проверки индукции белка NEIL1 в лизатахнеиндуцированных и индуцированных клетках методом ПААГ электрофреза.
Как видно из представленных данных, накопление белка NEIL1 происходит в водорастворимой и водонерастворимой фракциях. Для дальнейшей работы использовали надосадочную жидкость осветленноголизата. Лизис клеток осуществляли с использованием ультразвукового дезинтегратора. Очистку лизата от клеточногодебриса проводили центрифугированием на 40 000xg. Очистку белка проводили в два этапа:
осаждением с помощью сульфата аммония и использованием аффинной хроматографии.
Осаждение проводили при 57 % сульфата аммония. Далее осадок растворяли в буфереА
(100 мМKCL, 20 мМHepespH 7.6) после чего белковый раствор наносили на колонку HiTrapHeparin 1 ml. Эллюцию белка проводили с использованием ступенчатого градиента по KCl в диапазоне от 100 мМ до 1М. Белок NEIL1 сходил с колонки при концентрации KCl в 750 мМ. На данный момент проводится работа по оптимизации процедуры очистки данного белка.
В результате данной работы была показана возможность получения рекомбинантного белка NEIL1 в бактериальной системе экспрессии. Осуществлен начальный этап в очистки белка NEIL1. После оптимизации метода очистки данного белка будет проводиться его препаративная наработка и изучение его активности в условиях invitro.
