องค์ประกอบทางเคมีและฤทธิ์ทางชีวภาพของกิ่งต้นไข่เน่า

(1)

รายงานการวิจัย เรือง

องค์ประกอบทางเคมีและฤทธิ ทางชีวภาพของกิงต้นไข่เน่า

โดย

เสาวณีย์ คําพันธ์

ได้รับทุนอุดหนุนจากมหาวิทยาลัยราชภัฏสวนสุนันทา ปีงบประมาณ 2553

(2)

สารบัญ

หน้า

บทคัดย่อ (1)

Abstract (2)

กิตติกรรมประกาศ (3)

สารบัญ (4)

สารบัญตาราง (5)

สารบัญภาพ (6)

สัญลักษณ์และคําย่อ (7)

บทที 1 บทนํา 1

1.1 ความเป็นมาและความสําคัญของปัญหา 1

1.2 วัตถุประสงค์ของงานวิจัย 1

บทที 2 ผลงานวิจัยและงานเขียนอืนๆ ทีเกียวข้อง 2

บทที 3 วิธีการวิจัย 6

3.1 การสกัดสมุนไพรกิงไข่เน่า 7

3.2 การแยกส่วนสกัดหยาบ 9

3.3 การศึกษาฤทธิ ทางชีวภาพของสารสกัดสมุนไพรกิงไข่เน่า 13

บทที 4 ผลของการวิจัย 14

4.1. ผลการหาองค์ประกอบทางเคมีของสมุนไพรกิงไข่เน่า 14

4.2 ข้อมูลทางสเปกโตรสโกปีของสารทีแยกได้ 14

4.3 ผลการทดสอบฤทธิ ต้านเชื อแบคทีเรีย 20

บทที 5 สรุปผลการศึกษาและข้อเสนอแนะ

5.1 สรุปผลการศึกษา 22

5.2 ข้อเสนอแนะในการทําวิจัยในอนาคต 22

บรรณานุกรม 23

ประวัติผู้ทํารายงานการวิจัย 24

(3)

ภาพที หน้า

1. ภาพต้นไข่เน่าและขั นตอนการสกัดแยก 10

2. ¹H-NMR spectrum ของสาร 11 และ สาร 12 12

3.¹H-NMR spectrum ของสาร 2 14

4. ¹H-NMR spectrum ของสาร 8 14

5. ¹H-NMR spectrum ของสาร 1 14

(4)

สารบัญตาราง

ตารางที หน้า

4.1 ผลการทดสอบฤทธิ การต้านเชื อแบคทีเรีย 20

(5)

บทคัดย่อ

ชือรายงานการวิจัย : องค์ประกอบทางเคมีและฤทธิ ทางชีวภาพของกิงต้นไข่เน่า ชือผู้วิจัย : นางสาวเสาวณีย์ คําพันธ์

ปีทีทําการวิจัย : 2553

...

จากการศึกษาหาส่วนประกอบทางเคมีของกิงไข่เน่า (Vitex glabrata) สามารถแยกสาร สกัดหยาบชั นเฮกเซน เอทิลอะซิเตท และ เมทานอล ด้วยวิธีคอลัมน์โครมาโทกราฟีได้สาร 7 ชนิด ได้แก่ สารผสมระหว่าง beta-sitosterol (11) และ stigmasterol (12), 20-hydroxyecdysone (2), ajugasterone C (13), pterosterone (14), agnuside (8) และ turkesterone (1) พิสูจน์

โครงสร้างของสารโดยใช้เทคนิคสเปคโทรสโกปี

(6)

กิตติกรรมประกาศ

รายงานการวิจัยเรืององค์ประกอบทางเคมีและฤทธิ ทางชีวภาพของกิงต้นไข่เน่าได้รับ ความอนุเคราะห์อย่างดียิงจากบุคคลหลายท่านได้กรุณาช่วยเหลือให้ข้อมูลข้อเสนอแนะ ให้

คําปรึกษาแนะนํา ความคิดเห็น และกําลังใจ

ผู้เขียนขอกราบขอบพระคุณมหาวิทยาลัยราชภัฏสวนสุนันทาทีได้ให้ทุนอุดหนุนในการทํา วิจัยครั งนีให้สําเร็จได้ตามวัตถุประสงค์

ขอกราบขอบพระคุณ ศาสตราจารย์ ดร. อภิชาต สุขสําราญ อาจารย์ภาควิชาเคมี

คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยรามคําแหง ทีให้คําปรึกษาแนะนํา และให้ความอนุเคราะห์

อุปกรณ์และสารเคมีในส่วนทีมหาวิทยาลัยราชภัฎสวนสุนันทาไม่มี และขอกราบขอบพระคุณ ผู้ช่วยศาสตราจารย์ ดร.บุญเอก ยิงยงณรงค์กุล อาจารย์ภาควิชาเคมี คณะวิทยาศาสตร์

มหาวิทยาลัยรามคําแหง ทีได้แนะนํา ความคิดเห็นและให้กําลังใจในการวิจัย

ขอขอบคุณอาจารย์ทุกท่านในสาขาวิชาเคมี คุณทิวา ศักดิ ศรี เจ้าหน้าทีห้องปฏิบัติการ ทางเคมีทีคอยอํานวยความสะดวกในการใช้เครืองมือและอุปกรณ์ ตลอดระยะเวลาการทําวิจัย และ เจ้าหน้าที ทีได้ให้ความช่วยเหลือเป็นอย่างดีด้วยอัธยาศัยไมตรีทีอบอุ่นเป็นกันเอง

ขอขอบพระคุณ รองศาสตราจารย์ ดร. นันทนา อรุณฤกษ์ ภาควิชาโอษฐวิทยา คณะทันต แพทย์ศาสตร์ มหาวิทยาลัยศรีนครินทรวิโรฒ ทีให้ความอนุเคราะห์ในการทดสอบฤทธิ ต้านอนุมูล อิสระ

ขอขอบคุณ นายวิชญ รัชตเวชกุล นักศึกษาปริญญาเอก นางสาวณัฐธิสา นิยมธรรม นักศึกษาปริญญาโท สาขาเคมีประยุกต์ คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยรามคําแหง อนุเคราะห์ใน การบันทึกข้อมูลทาง NMR spectrum และ mass spectrum

ท้ายสุดนี ขอกราบขอบพระคุณบิดา มารดา และขอขอบคุณน้องและเพือนทีได้ช่วย ส่งเสริมสนับสนุน และเป็นกําลังใจตลอดมาให้ผู้เขียนจัดทํารายงานการวิจัย

เสาวณีย์ คําพันธ์

กันยายน 2553

(7)

บทนํา

1.1 ความเป็นมาและความสําคัญของปัญหา

ปัจจุบันคนไทยและสังคมโลกหันมาดูแลสุขภาพของตนเองโดยนิยมใช้สมุนไพร หรือมองมาทีธรรมชาติบําบัด ทําให้ผู้วิจัยสนใจทีจะนําสมุนไพรพื นบ้านมาทําการหาสารที

มีฤทธิ ทางยา ได้แก่ต้นไข่เน่า ต้นไข่เน่าเป็นไม้ต้นผลัดใบ สูง 5–15 เมตรมีการกระจาย พันธุ์ในป่าเบญจพรรณแล้งและป่าดิบแล้ง ทัวทุกภาคของประเทศ ผลสุกมีรสหวาน กินได้

เปลือกต้นและรากใช้ปรุงเป็นยาฝาดสมาน แก้ท้องร่วง และเป็นยาเจริญอาหาร จาก การศึกษาเบืองต้นของกลุ่มวิจัยอาจารย์ กิติพงษ์ วีรพัฒนเมธิน และศาสตราจารย์ อภิชาต สุขสําราญ มหาวิทยาลัยรามคําแหง พบว่าสารเคมีทีต้นไข่เน่าผลิตในปริมาณทีมากคือ เอคไดสเตียรอยด์ และต้นไข่เน่าผลิตสารเคมีชนิดนี มาเพือต่อสู้กับแมลง ถ้าแมลงกินพืชที

มีเอคไดสเตียรอยด์อยู่ ก็จะเป็นอันตรายต่อแมลง นอกจากยังมีรายงานจากกลุ่มนักวิจัย อืนๆ ในการนําเอคไดสเตียรอยด์มาทําการมาใช้เป็นยาชูกําลัง และ anti-aging agent (Lafont และ Dinan, 2003) ผู้วิจัยจึงมีประสงค์ทีจะนําทรัพยากรธรรมชาติทีไม่มีค่ามาใช้

ให้เป็นประโยชน์เชิงพาณิชย์และการใช้ยาทางเลือกจากสมุนไพรจึงน่าจะเป็นแนวทางช่วย แก้ ปัญหาสาธารณสุขและการแพทย์ได้

1.2 วัตถุประสงค์ของการวิจัย

1. สกัดและแยกสารเคมีจากสมุนไพรกิงของไข่เน่า

2. ทดสอบฤทธิ ทางชีวภาพจากส่วนสกัดต่าง ๆ ของสารทีแยกได้จากสมุนไพรกิงไข่เน่า 3. ตรวจหาสารบริสุทธิ และวิเคราะห์โครงสร้างขององค์ประกอบทางเคมีของสาร

(8)

บทที 2

ผลงานวิจัยและงานเขียนอืน ๆ ทีเกียวข้อง

โลกในยุคปัจจุบันมีการตืนตัวในการนําสมุนไพรหรือยาพื นบ้านมาใช้ในการรักษาโรคต่างๆ ควบคู่กันกับยาแผนปัจจุบัน ไข่เน่า (Vitex glabrata) จัดว่าเป็นสมุนไพรชนิดหนึงทีน่าสนใจ และมี

สรรพคุณหลายอย่าง

พืชในสกุล Vitex มีรายงานการศึกษาส่วนประกอบทางเคมีทีน่าสนใจ โดยมีการพบกลุ่ม สารหลาย กลุ่ม คือ Ecdysteroid , iridoids ดังงานวิจัยทียกมาพอสังเขปดังนี

ในปี1986 Werawattanametin และคณะ รายงานส่วนประกอบทางเคมีทีแยกได้จาก เปลือกต้นของ Vitex Glabrata พบสารในกลุ่ม Ecdysteroid ได้แก่ 11α,20-dihydroxyecdysone (1) หรือ tuekesterone

11α,20-dihydroxyecdysone (1)

ในปี 1993 Suksamrarn และ Sommechai รายงานส่วนประกอบทางเคมีทีแยกได้จาก เปลือกต้นของ Vitex pinnata L. พบสารในกลุ่ม Ecdysteroid ได้แก่ 20-Hydroxyecdysone (2), Pinnatasterone (3)

22

H O

OH

OH HO

HO

HO OH

3 HO

(9)

H O

OH

OH HO

HO

H HO OH

20-hydroxyecdysone (2)

H O

OH

OH HO

HO

H

HO OH

Pinnatasterone (3)

ในปี1997 Suksamrarn และคณะรายงานส่วนประกอบทางเคมีทีแยกได้จากเปลือกราก ของ Vitex canescens พบสารในกลุ่ม Ecdysteroid ได้สารใหม่ 1 ชนิดได้แก่ 24-epi-

abutasterone (4)

ในปี 2002 Suksamrarn และคณะ รายงานส่วนประกอบทางเคมีทีแยกได้จากกิงของ Vitex peduncularis พบสารกลุ่ม iridoids ได้สารใหม่ 1ชนิดได้แก่ peduncularis (5)

HO

O H H

COOH₂C O

H HO

H HO O

OH

OH OH H₃CO

Peduncularis (5)

OH

HO

OH

H O

OH

24-epi-Abutasterone (4)

(10)

4

ในปี 2001 Tereza และคณะแยกได้สารในกลุ่ม iridoids จากใบของ Vitex cymosa ได้แก่ tarumal (6), viteoid II (7) and agnuside (8)

O

CHO O

Tarumal (6)

O

HO O

HO H

Viteoid II (7)

ในปี 2004 Sridhar และคณะรายงานส่วนประกอบทางเคมีทีแยกได้จากใบของ Vitex altissimaพบสารกลุ่ม iridoids ได้สารใหม่ 2 ชนิดได้แก่ 2´-O-p-hydroxybenzoylgardoside (9), 2´-O-p-hydroxybenzoyl-8-epiloganic acid (10)

O

O HO

OGlu HO

Agnuside (8)

(11)

O H H

O COOH

H3C HO

CH₃

H

O

HO

HO H O

O

OH

O H H

O COOH

H HO

CH3

H

O

HO

HO H O

O

OH

2´-O-p-hydroxybenzoylgardoside (9) 2´-O-p-hydroxybenzoyl-8-epiloganic acid (10)

(12)

บทที 3

วิธีการวิจัย

การวิจัยนีแบ่งการศึกษาออกเป็น 3 ตอน ได้แก่ การสกัด การแยกสารสกัดและการศึกษา โครงสร้างของสารทีแยกได้จากสารสกัดสมุนไพรกิงไข่เน่า

อุปกรณ์/เครืองมือและสารเคมี

วัสดุและสารเคมี

1. ตัวทําละลายอินทรีย์ต่างๆ ซึงทําให้บริสุทธิ ด้วยการกลัน 2. Absolute ethanol (Analytical grade; Clrlo Erba : 414608) 3. Dichloromethane

4. Ethyl acetate 5. Hexane 6. Methanol 7. สารดูดซับ

Silica gel สําหรับ Column chromatography -Silica gel (0.063-200 mm, Merck 1.07734) -Silica gel (<0.063mm, Merck 1.07729)

Silica gel สําหรับ quick column chromatography -Silica gel (<0.063mm, Merck 1.07785)

8. Developing reagent (anisaldehyde: conc. H₂SO₄: H₂ : Absolute ethanol ในอัตราส่วน (2: 3: 2: 90)

อุปกรณ์และเครืองมือ

1. หลอดกําเนิดแสงอัลตราไวโอเลต ทีความยาวคลืน 254 และ 366 nm

2. เครืองหาจุดหลอมเหลว

(13)

3. Nuclear magnetic resonance spectrometer (Bruker Avance 400)

4. Rotary evaporator (Buchi Rotavapor R-211)

3.1 การสกัดสมุนไพรกิงไข่เน่า

ทีมาของ กิงไข่เน่า (Vitex glabrata)

พืชทีใช้ศึกษาในครั งนี นํามาจาก : ต. ดอนปรู อ. ศรีประจันต์ จ. สุพรรณบุรี

เก็บในช่วงเดือน : เดือน ธันวาคม ปี 2552

ภาพที 1 รต้นไข่เน่าและขั นตอนการสกัดแยก

(14)

8

3.1.1 การสกัดกิงไข่เน่าในชั นเฮกเซน (Hexane)

นํากิงไข่เน่ามาทําความสะอาดเพือกําจัดสิงสกปรกออก ผึงแดดให้แห้งแล้วนํามาสับ ให้เป็นชิ นเล็กๆ แล้วนําไปบดให้ละเอียด นํ าหนัก 4,028 กรัม ทําการสกัดด้วยเฮกเซน (Hexane จํานวน 4 ลิตร ให้ท่วม ปิดฝาขวดไว้ให้สนิทเพือป้องกันตัวทําละลายระเหยออก แช่สารเป็นเวลา 5 วัน โดยสกัดซํ า 3 ครั ง เมือแช่ครบกําหนดแล้วนําออกมากรองด้วยสําลี

เพือแยกเอาสารละลายออกมา และรวมกันทั ง 3 ครั ง

3.1.2 การสกัดกิงไข่เน่าในชั นเอตทิล อะซิเตต (Ethyl acetate)

ส่วนกากทีเหลือจากชั นเฮกเซน นํามาสกัดด้วยตัวทําละลาย Ethyl acetate อีก โดย สกัดซํ า 3 ครั ง ครั งละ 4 ลิตร แล้วทําตามข้อ 3.1.1

3.1.3 การสกัดกิงไข่เน่าในชั นเมทานอล (Methanol)

ส่วนกากทีเหลือจากชั นเอตทิล อะซิเตต นํามาสกัดด้วยตัวทําละลาย Methanol โดย สกัดซํ า 3 ครั งครั งละ 4 ลิตร แล้วทําตามข้อ 3.1.1 นําสารละลายในแต่ละชั นไประเหยตัว ทําละลายออกให้หมดด้วยเครือง Vacuum Rotary Evaporator จะได้ส่วนสกัดหยาบของ แต่ละชั น ซึงเราเรียกว่า ครูด (Crude) ได้แก่ Crude Hexane นํ าหนัก 13.51 กรัม Crude Ethyl acetate นํ าหนัก 31.46 กรัม และ Crude Methanol นํ าหนัก 125.72 กรัม ดังแสดง ในแผนผังที 1

กิงไข่เน่าบดแห้ง 4,028 กิโลกรัม

Hexane (3×4L)

ส่วนสกัด Hexane กาก

13.51 กรัม EtOAc (3×4L)

ส่วนสกัด EtOAc กาก

31.46 กรัม MeOH (3×4 L)

ส่วนสกัด MeOH กาก 125.72 กรัม

ทิ ง แผนผังที 1 แสดงการสกัดสารจากกิงไข่เน่าด้วยตัวทําละลาย 3 ชนิด

(15)

3.2 การแยกส่วนสกัดหยาบ

3.2.1 ส่วนสกัดหยาบชั นเฮกเซน (Hexane extract) กิงไข่เน่า

นําส่วนสกัดหยาบเฮกเซนของกิงไข่เน่า นํ าหนัก 13.51 g มาทําการแยกด้วยวิธีคอลัมน์โคร มาโท กราฟี โดยใช้ silica gel ขนาด 7734 เป็นตัวดูดซับและทําการแพ็คคอลัมน์ด้วย 100%

Hexane ทําการชะคอลัมน์ด้วยระบบตัวทําละลาย 100% Hexane, Hexane : CH₂Cl₂ และ โดย ค่อยๆเพิมขึ นทีละ 5% CH₂Cl₂จนถึง 100% CH₂Cl₂ และ 1% MeOH ตามลําดับ ในขณะทีทําการ ชะคอลัมน์ต้องเก็บสารทีไหลออกมาจากคอลัมน์ทุกๆ 100 mL โดยประมาณ แล้วทําการตรวจสอบ ด้วย TLC โดยใช้ระบบตัวทําละลายต่างๆ พบว่าสามารถแบ่งสารได้เป็น 62 fractions ย่อย และ รวม fractions ได้ 17 fractions และได้สารกลุ่มทีเป็น ไตรเทอร์ปีน (triterpene) ซึงเป็นสารผสม มี

ลักษณะเป็น amorphous solid ได้แก่ beta – sitosterol (11) และ stigmasterol (12)

3.2.2 ส่วนสกัดหยาบชั นเอทิล อะซิเตต (Ethyl acetate extract) กิงไข่เน่า

นําส่วนสกัดหยาบเอตทิล อะซิเตตของกิงไข่เน่า นํ าหนัก 31.46 กรัม มาทําการแยกด้วยวิธี

คอลัมน์ โครมาโทกราฟี โดยใช้ silica gel ขนาด 7734 เป็นตัวดูดซับและทําการแพ็คคอลัมน์

ด้วย 100% Hexane ทําการชะคอลัมน์ด้วยระบบตัวทําละลาย 80% Hexane, Hexane: EtoAc โดยค่อยๆเพิม 10% EtoAc ตามลําดับ ขณะทีทําการชะคอลัมน์ต้องเก็บสารทีไหลออกมาจาก คอลัมน์ทุกๆ 100 mL โดยประมาณ แล้วจึงทําการตรวจสอบด้วย TLC โดยใช้ระบบตัวทําละลาย ต่างๆ พบว่าสามารถแบ่งสารได้เป็น 71 fractions ย่อย และรวม fractions ได้ 22 fractions มี

ลักษณะเป็น amorphous solid ดังแสดงในแผนผังที 2

(16)

10

VG (S)-EA-11/31.46 g

Hexane : EtOAc: MeOH

Fr.1 Fr.2 Fr.3 Fr.4 Fr.5 Fr.6 Fr.7 Fr.8 Fr.9 Fr.10 ... Fr.22

Fr.1 VG(S)-EA-11/1-4 (0.4177 g) Fr.13 VG(S)-EA-11/37-44 (0.2172 g) Fr.2 VG(S)-EA-11/5 (1.3480 g) Fr.14 VG(S)-EA-11/45-48 (0.4309 g) Fr.3 VG(S)-EA-11/6-7 (2.4661 g) Fr.15 VG(S)-EA-11/49-52 (0.1154 g) Fr.4 VG(S)-EA-11/8-12 (0.8803 g) Fr.16 VG(S)-EA-11/53-56 (0.3669 g) Fr.5 VG(S)-EA-11/13 (0.0704 g) Fr.17 VG(S)-EA-11/57-60 (0.3642 g) Fr.6 VG(S)-EA-11/14-16 (0.3136 g) Fr.18 VG(S)-EA-11/61-63 (0.4428 g) Fr.7 VG(S)-EA-11/17-20(0.5183 g) Fr.19 VG(S)-EA-11/64-66 (1.968 g)

Fr.8 VG(S)-EA-11/21-24 (1.5591 g) Fr.20 VG(S)-EA-11/67-68 (0.1177 g) Fr.9 VG(S)-EA-11/25-26 (1.7832 g) Fr.21 VG(S)-EA-11/69 (0.7447 g)

Fr.10 VG(S)-EA-11/27-28(0.0989 g) Fr.22 VG(S)-EA-11/70-71 (0.8609g ) Fr.11 VG(S)-EA-11/29-32(1.8280 g)

Fr.12 VG(S)-EA-11/33-36 (0.7584 g)

แผนผังที 2 แสดงการแยกส่วนสกัดหยาบชั น Ethyl acetate ของกิงไข่เน่า

นํา fractions ที 19 VG (S)- EA-11/64-66 (1.968 กรัม) ชั น Ethyl acetate นํ าหนัก 1.968 g และทําการแยกต่ออีก 4 ครั ง ได้นํ าหนัก โดยใช้ silica gel ขนาด 7729 เป็นตัว ดูดซับและทําการแพ็คคอลัมน์ด้วย 100% EtOAc ทําการชะคอลัมน์ด้วยระบบตัวทําละลาย 90%

EtOAc , EtOAc:MeOH โดยค่อยๆเพิม 1% MeOH ตามลําดับ แล้วตรวจสอบด้วย TLC ระบบตัว ทําละลายต่างๆ พบว่าสามารถแบ่งสารได้เป็น 8 fractions จากนั นนํา fractions ที 4 ไปทําการ

(17)

แยกต่อโดยใช้ silica gel ขนาด 7729 เป็นตัวดูดซับและทําการแพ็คคอลัมน์ด้วย 100% EtOAc ทําการชะคอลัมน์ด้วยระบบตัวทําละลาย 90% EtOAc, EtOAc:MeOH โดยค่อยๆเพิม 1%

MeOH ตามลําดับ แล้วตรวจสอบด้วย TLC ระบบตัวทําละลายต่างๆ พบว่าสามารถแบ่งสารได้

เป็น 9 fractions จากนั นนํา fractions ที 4 ไปทําการแยกต่อโดยใช้ silica gel ขนาด 7729 เป็นตัว ดูดซับและทําการแพ็คคอลัมน์ด้วย 100% EtOAc ทําการชะคอลัมน์ด้วยระบบตัวทําละลาย 91%

EtOAc, EtOAc:MeOH โดยค่อยๆเพิม 1% MeOH ตามลําดับ แล้วตรวจสอบด้วย TLC ระบบตัว ทําละลายต่างๆ พบว่าสามารถแบ่งสารได้เป็น 1 fractions จากนั นนํา fractions ทีได้ไปทําการ แยกต่อโดยใช้ silica gel ขนาด 7729 เป็นตัวดูดซับและทําการแพ็คคอลัมน์ด้วย 100% CH₂Cl₂ ทําการชะคอลัมน์ด้วยระบบตัวทําละลาย 92% CH₂Cl₂, CH₂Cl₂:MeOH โดยค่อยๆเพิม 1%

MeOH ตามลําดับ แล้วตรวจสอบด้วย TLC ระบบตัวทําละลายต่างๆ พบว่าสามารถแบ่งสารได้

เป็น 6 fractions จากนั นนํา fractions ที4 ไปทําการแยกต่อโดยใช้ RP-18 เป็นตัวดูดซับและทํา การแพ็คคอลัมน์ด้วย 100%MeOH ทําการชะคอลัมน์ด้วยระบบตัวทําละลาย 90% H₂O,

H₂O:MeOH โดยค่อยๆเพิม 10% MeOH แล้วตรวจสอบด้วย TLC ระบบตัวทําละลายต่างๆ พบว่า สามารถแยกสารบริสุทธิ 3 ชนิดได้แก่ 20- hydroxyecdysone (2), ajugasterone C (13) และ pterosterone (14)

3.2.3 ส่วนสกัดหยาบชั นเมทานอล (Methanol extract) กิงไข่เน่า

นําส่วนสกัดหยาบเมทานอลของกิงไข่เน่า นํ าหนัก 125.72 กรัม มาทําการแยกด้วยวิธี

คอลัมน์โครมาโทกราฟี โดยใช้ silica gel ขนาด 7747 เป็นตัวดูดซับและทําการแพ็คคอลัมน์ด้วย

(18)

12

โดยค่อยๆเพิมขึ นทีละ 5% MeOH และสุดท้ายเป็น 50% CH₂Cl₂:50% MeOH ตามลําดับ ในขณะ ทีทําการชะคอลัมน์ต้องเก็บสารทีไหลออกมาจากคอลัมน์ทุกๆ 200 mL โดยประมาณ แล้วจึงทํา การตรวจสอบด้วย TLC โดยใช้ระบบตัวทําละลายต่างๆ พบว่าสามารถแบ่งสารได้46 fractions ย่อย และรวม fractions ได้ 14 fractions มีลักษณะเป็น amorphous solid ดังแสดงในแผนผังที

3

VG (s)-M-9/125.72 g

CH₂Cl₂ : MeOH

Fr.1 Fr.2 Fr.3 Fr.4 Fr.5 Fr.6 Fr.7 Fr.8 Fr.9 Fr.10 Fr.11 Fr.12..Fr.13 Fr.1 VG(S)-M-9/1 (1.479 g) Fr.8 VG(S)-M-9/20-23 (5.6924 g) Fr.2 VG(S)-M-9/2-3 (0.9697 g) Fr.9 VG(S)-M-9/24-27 (8.0670 g)

Fr.3 VG(S)-M-9/4-7 (0.1026 g) Fr.10 VG(S)-M-9/28-31 (5.2439 g) Fr.4 VG(S)-M-9/8-10 (0.2968 g) Fr.11 VG(S)-M-9/32-35 (5.4806g) Fr.5 VG(S)-M-9/11-13 (1.3300 g) Fr.12 VG(S)-M-9/36-39 (15.7055 g) Fr.6 VG(S)-M-9/14-17 (2.9403 g) Fr.13 VG(S)-M-9/40-43 (31.2601 g)

Fr.7 VG(S)-M-9/18-19 (2.3542 g) Fr.14 VG(S)-M-9/44-46 (11.3209g)

แผนผังที 3 แสดงการแยกส่วนสกัดหยาบชั น Methanol ของกิงไข่เน่า

ในการแยกคอลัมน์ของ Fractions ที 8 VG (S)-M-9/20-23 ในชั น Methanol นํ าหนัก 5.692 g และทําการแยกคอลัมน์ต่ออีก 2 ครั ง ครั งแรกได้นํ าหนัก 2.348 กรัม โดยใช้ silica gel ขนาด 7734 เป็นตัวดูดซับและทําการแพ็คคอลัมน์ด้วย 100% CH₂Cl₂ ทําการชะคอลัมน์ด้วยระบบตัวทํา ละลาย 100% CH₂Cl₂, 100% CH₂Cl₂:MeOH โดยค่อยๆเพิมขึ นทีละ 5% MeOH และสุดท้าย เป็น 50%CH₂Cl₂:50% MeOH ตามลําดับ และครั งที 2 ได้นํ าหนัก 638.1 mg แต่ครั งที 2 ทําการ แยกคอลัมน์ โดยใช้ RP-18 ใน H₂O:MeOH แล้วตรวจสอบด้วย TLC โดยใช้ระบบตัวทําละลาย ต่างๆ พบว่าสามารถแบ่งสารได้ 7 fractions และได้สารทีบริสุทธิ ใน fractions ที 4 มีลักษณะเป็น amorphous solid ชือว่า agnuside (8)

(19)

ในการแยกคอลัมน์ของ Fractions ย่อย ที 5 VG(S)-M-51/11-24 ทําในทํานองเดียวกับ ข้างต้น สามารถแบ่งสารได้เป็น 8 fractions และได้สารทีบริสุทธิ ใน fractions ที 4 และ 7 มี

ลักษณะเป็น amorphous solid ได้แก่ turkesterone (1) และ 20-hydroxyecdysone (2)

3.3 การศึกษาฤทธิทางชีวภาพของสารสกัดสมุนไพรกิงไข่เน่า

ได้ส่งสารสกัดทีทําการกสดได้ไปทดสอบที รองศาสตราจารย์ ดร. นันทนา อรุณฤกษ์

ภาควิชาโอษฐวิทยา คณะทันตแพทย์ศาสตร์ มหาวิทยาลัยศรีนครินทรวิโรฒ

(20)

บทที 4

ผลของการวิจัย

4.1. ผลการหาองค์ประกอบทางเคมีของสมุนไพรกิงไข่เน่า

จากการศึกษาส่วนประกอบทางเคมีของสมุนไพรกิงไข่เน่า (Vitex glabrata) สามารถแยก สารบริสุทธิ จากส่วนสกัดเฮกเซน เอทิล อะซีเตตและส่วนสกัดเมทานอลรวมทั งสิน 7 ชนิด การหา เอกลักษณ์ของสารดังกล่าวอาศัยข้อมูลทางสเปกโทรสโกปี

4.2 ข้อมูลทางสเปกโตรสโกปีของสารทีแยกได้

Beta- sitosterol (11) และ Stigmasterol (12)

มีลักษณะเป็น ผลึกรูปเข็ม สีขาว นํ าหนัก 11.3 mg การยืนยันโครงสร้างได้จาก การเปรียบเทียบ TLC และ ¹H-NMR กับสารทีเคยแยกได้ในสารสกัดจากธรรมชาติและสอดคล้อง กับข้อมูลทีมีผู้รายงานไว้ จึงสรุปว่าเป็น สารผสมระหว่าง beta-sitosterol (11) และ Stigmasterol (12) ดังแสดงในภาพที 2

ภาพที 2 ¹H-NMR spectrum ของสาร 11 และ สาร 12

(21)

beta - Sitosterol (11) Stigmasterol (12)

20-Hydroxyecdysone (2)

มีลักษณะเป็น amorphous solid นํ าหนัก 1.02 กรัม การยืนยันโครงสร้างได้จากการ เปรียบเทียบ TLC และ ¹H-NMR กับสารทีเคยแยกได้ในสารสกัดจากธรรมชาติและสอดคล้องกับ ข้อมูลทีมีผู้รายงานไว้ จึงสรุปว่าเป็น 20-Hydroxyecdysone (2) ดังแสดงในภาพที 3

รูปที 3 ¹H-NMR spectrum ของสาร 2

(22)

16

H O

OH

OH HO

HO

H

HO^OH

20-Hydroxyecdysone (2)

Ajugasteron C

มีลักษณะเป็น amorphous solid นํ าหนัก 2.2 mg การยืนยันโครงสร้างได้จากการ เปรียบเทียบ TLC กับสารทีเคยแยกได้ในสารสกัดจากธรรมชาติและสอดคล้องกับข้อมูลทีมี

ผู้รายงานไว้ จึงสรุปว่าเป็น Ajugasteron C (13)

H O

H

OH HO

HO

H OHOH

Ajugasterone C (13)

HO

Pterosterone (14)

มีลักษณะเป็น amorphous solid นํ าหนัก 3.1 g การยืนยันโครงสร้างได้จากการ เปรียบเทียบ TLC กับสารทีเคยแยกได้ในสารสกัดจากธรรมชาติและสอดคล้องกับข้อมูลทีมี

ผู้รายงานไว้ จึงสรุปว่าเป็น Pterosterone (14)

(23)

H O

H

OH HO

HO

H OHOH

Pterosteron (14)

OH

Agnuside (8)

มีลักษณะเป็น amorphous solid นํ าหนัก 4.2 mg การยืนยันโครงสร้างได้จากการ เปรียบเทียบ TLC และ ¹H-NMR กับสารทีเคยแยกได้ในสารสกัดจากธรรมชาติและสอดคล้องกับ ข้อมูลทีมีผู้รายงานไว้ จึงสรุปว่าเป็น Agnuside (8) ดังแสดงในภาพที 4

รูปที 4 ¹H-NMR spectrum ของสาร 8

(24)

18

HO

O H H

COOH₂C O

H HO

H

HO O

OH OH OH

Agnuside (8) Turkesterone (1)

มีลักษณะเป็น amorphous solid นํ าหนัก 1.5 mg การยืนยันโครงสร้างได้จากการเปรียบเทียบ TLC และ ¹H-NMR กับสารทีเคยแยกได้ในสารสกัดจากธรรมชาติและสอดคล้องกับข้อมูลทีมี

ผู้รายงานไว้ จึงสรุปว่าเป็น Turkesterone (1)ดังแสดงในภาพที 5

ภาพที 5 ¹H-NMR spectrum ของสาร 1

H O

OH

OH HO

HO

H OHOH

Turkesterone (1)

HO

(25)

4.3 ผลการทดสอบฤทธิ ต้านเชื อแบคทีเรีย

สารสกัดชั นเฮกเซน เอทิลอะซิเตต และ เมทานอล ไม่มีฤทธิในการต้านเชื อแบคทีเรีย ดัง แสดงในตาราง 4.1

(26)

บทที 5

สรุปผลการศึกษาและข้อเสนอแนะ

5.1 สรุปผลการศึกษา

จากการศึกษาองค์ประกอบทางเคมีของกิงไข่เน่าโดยการสกัดด้วยตัวทําละลาย เฮกเซน เอตทิลอะเตต และเมทานอล ใช้กิงไข่เน่านํ าหนัก 4028.0 กรัมได้ส่วนสกัด 3 ชนิด คือส่วนสกัด หยาบกิงไข่เน่าในชั นเฮกเซน (13.51 g) ส่วนสกัดหยาบของกิงไข่เน่าเอตทิลอะชิเตตค (31.46 g) และส่วนสกัดหยาบของกิงไข่เน่าในชั นเมทานอล (125.72 g) ทําการแยกสารให้บริสุทธิ โดยเทคนิค คอลัมน์โดยการใช้เทคนิคโครมาโทกราฟี และใช้เทคนิคทางสเปคโตรสโกปีในการพิสูจน์โครงสร้าง สาร ทําการแยกตามชนิดของตัวทําละลายอินทรีย์ต่างๆ ดังนี

ส่วนสกัดของชั นเฮกเซน จะได้ สารผสม 2 ชนิด ได้แก่สารทีเป็นกลุ่มของ triterpene คือ beta - sitosterol (11) ผสมอยู่กับ stigmasterol (12)

ส่วนสกัดของชั นเอตทิลอะชิเตต จะได้สารบริสุทธิ ทั งหมด 3 ชนิด ได้แก่สารทีเป็นกลุ่ม เอค ไดสเตียรอยด์ (Ecdysteroid) ได้แก่ 20-hydroxyecdysone (2), ajugasterone C (13), pterosterone (14)

ส่วนสกัดของชั น เมทานอลได้สารบริสุทธิ ทั งหมด 2 ชนิด ชนิดแรก ได้แก่สารกลุ่ม อิริดอยด์ (Iridoid) ชนิดที 2 เป็นกลุ่มของเอคไดสเตียรอยด์ (Ecdysteroid) ได้แก่ agnuside (8) และ turkesterone (1) ตามลําดับ

สารสกัดทีได้จากสมุนไพรชนิดนี ไม่มีฤทธิ ในการต้านเชื อแบคทีเรีย

5.2 ข้อเสนอแนะในการทําวิจัยในอนาคต

5.2.1 ไม่ค่อยมีผู้ร่วมงานทีทําทางด้านฤทธิ ทางชีวภาพ

5.2.2 ควรหาองค์ประกอบทางเคมีของสมุนไพรชนิดอืนๆ อีกเพือเป็นประโยชน์ต่อไป

(27)

บรรณานุกรม

1. Lafont R., and Dinan L. 2003. Practical uses for ecdysteroids in mammals including humans. J. Insect Scie. 1-30.

2. Sridhar, C., Subbaraju, G. V., Venkateswarlu, Y. and Venugopal, R. T. 2004 New acylated iridoid glucosides from Vitex altissima J. Nat. Prod. 67: 2012- 2016.

3. Suksamrarn, A. and Sommechai C. 1993. Ecdysteroids from Vitex pinnata.

Phytochemistry 32: 303-306.

4. Suksamrarn, A., Promrangsan, N., Chitkul, B., Homvisasevongsa, S., and Sirikate, A. 1997. Ecdysteroids from Vitex canescens Phytochemistry 45:

1149-1152.

5. Suksamrarn, A., Kumpun, S., Kirtikara, K., Yingyongnarongkul, B. and Suksamrarn S. 2002. Iridoids with Anti-Inflammatory Activity from Vitex peduncularis Planta Med.68: 72-73.

6. Tereza, C. S., Schripsema , J., Monache, F.D. and Leitao, S. G. 2001. Iridoids from Vitex cymosa J. Braz. Chem. Soc.12: 763-766.

7. Werawattanametin, K., Podimuang, V. and Suksamrarn., A. 1986. Ecdyetroid from Vitex glabrata. J. Nat. Prod. 49: 364-365.

(28)

ประวัติผู้เขียน

เสาวณีย์ คําพันธ์

ประวัติการศึกษา

พ.ศ. 2539 วิทยาศาสตร์บัณฑิต (เคมี) จากมหาวิทยาลัยรามคําแหง

พ.ศ. 2544 วิทยาศาสตร์มหาบัณฑิต (เคมีประยุกต์) จากมหาวิทยาลัยรามคําแหง พ.ศ. 2549 ปราชญาดุษฎีบัณฑิต(เคมีประยุกต์) จากมหาวิทยาลัยรามคําแหง

ตําแหน่งและสถานทีทํางานปัจจุบัน

หัวหน้าสาขาวิชาเคมี คณะวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี

มหาวิทยาลัยราชภัฏสวนสุนันทา

ประสบการณ์ ผลงานทางวิชาการ รางวัลหรือทุนการศึกษาเฉพาะทีสําคัญ

List of Poster Presentations

1. Saowanee Kumpun, Boon-ek Yingyongnarongkul and Apichart Suksamrarn.

Iridoids from a Vitex Species. 1998. 24th Congress on Science and Technology of Thailand, Queen Sirikit National Convention Center Bangkok, 19-21 October 1998.

2. Saowanee Kumpun, Boon-ek Yingyongnarongkul, Waraphot Haritakun and Apichart Suksamrarn. Synthesis and Biological Activity of 24-and 26-Azides of 25-Deoxyedcdysteroids. 1999. 25th Congress on Science and Technology of Thailand, Amarin Lagoon Hotel Pitsanuloke, 20-22 October 1999.

3. Boon-ek Yingyongnarongkul, Saowanee Kumpun and Apichart Suksamrarn.

Partial Senthesis and Moulting Hormone a ctivity of Some Ecdysteroids and Analogues. 1999. The Fourth Princess Chulabhorn International Science Congress Chemicals in the 21st Century. Bangkok Thailand. 28 November-2 December 1999.

(29)

2001. 27th Congress on Science and Technology of Thailand, Lee Gardens Plaza Hotel, Hat Yai, Songkla, Thailand, 16-18 October 2001.

6. Saowanee Kumpun, Tipphawan Chuprajob, Boon-ek Yingyongnarongkul Nitirat Chimnoi and Apichart Suksamrarn. Chemical Modifications at The 3-Hydroxyl group of 20-Hydroxyecdysone. 2003. 29th Congress on Science and Technology of Thailand, Golden Jubilee ConventionHall Khon Kaen University, 20-22 October 2003.

7. Saowanee Kumpun, Boon-ek Yingyongnarongkul and Apichart Suksamrarn.

Synthesis of Integristerone A. 2004. 30th Congress on Science and Technology of Thailand, Impact Exhibition and Convention Center, Muang Thong Thani, 19-21 October 2004.

8. Aroon Jankam, Boon-ek Yingyongnarongkul, Saowanee Kumpun and Apichart Suksamrarn. Synthesis Absolute Configuration and Moulting Activity of 26- Haloponasterone A. 2004. 30th Congress on Science and Technology of Thailand, Impact Exhibition and Convention Center, Muang Thong Thani, 19-21 October 2004.

9. Kanjana Wangkrajang, Aroon Jankam, Saowanee Kumpun, Apchart Suksamrarn and Boon-ek Yinngyongnarongkul. 2005.Antifungal anthraquinones From The Roots of Prismatomeris Filamentosa. 31th Congress on Science and Technology of Thailand. Technopolis, Suranaree University of Technology, Nakhon Ratchasima, 18-20 October 2005.

10. Saowanee Kumpun, Jean-Pierre Girault, Catherine Blais, Annick Maria, Chantal Dauphin-Villemant, Boon-ek Yingyongnarongkul, Apichart Suksamrarn, Rene Lafont. 20-Hydroxyecdysone metabolism in mice. RGJ-Ph.D. Congress VIII.

Jomtien Palm Beach Resort Pattaya, Chonburi, 20-22 April, 2007. (Outstanding poster presentation award)

11. Saowanee Kumpun, Nualkhae Sangkhakaro, Rodjana Intachai, Yupin Dongpikit,

(30)

Congress on Science and Technology of Thailand, Queen Sirikit National Convention Center Bangkok, 31 October-2 December 2008.

12. Saowanee Kumpun, Tasanee Srimuang, Napawan Kampairao, Teerapong Kammongkol, Boon-ek Yingyongnarongkul, 2010. Study on Chemical Constituents of the Twigs of Vitex Glabrata. 36th Congress on Science and Technology of Thailand (STT 36), Bangkok International Trade & Exhibition Center (BITEC) Bangkok, 26^th -28^th October 2010.

List of Publications

1. Suksamrarn, A., Kumpun, S., Kirtikara, K., Yingyongnarongkul, B. and Suksamrarn S. (2002) Iridoids with Anti-Inflammatory Activity from Vitex peduncularis. Planta Med. 68, 72-73.

2. Suksamrarn, A., Kumpun, S. and Yingyungnarongkul, B. (2002) Ecdysteroids of Vitex scabra Stem bark. J. Nat. Prod. 65, 1690-1692.

3. Yingyungnarongkul, B., Kumpun, S. and Chimnoi, N. (2005) C-25 epimeric 26- haloponasterone A: Synthesis, absolute configuration and moulting activity.

Steroids 70, 636-644.

4. Odinokov, V. N., Kumpun, S., Galyautdinov, I. V., Evrard-Todeschi, N., Veskina, N. A., Khalilov, L. M., Girault, J. P., Dinan, L., Maria, A. and Lafont, R. (2005) Low-Polarity Phytoecdysteroids from the Juice of Serantula colonata L.

(Asteraceae). Collect. Czech. Chem. Commun. 70, 2038-2052.

5. Kumpun, S., Yingyongnarongkul, B., Lafont, R., Girault, J. P. and Suksamrarn. A.

(2007) Stereoselective synthesis and moulting activity of integristerone A and analogues. Tetrahedron 63, 1093-1099.

6. Kumpun, S., Maria, A., Crouzet, S., Evrard-Todeschi, N. Girault,J. P., Lafont, R.

(2011) Ecdysteroids from Chenopodium quinoa, an ancient Andine crop of high nutritional value. Food Chemistry 125, 1226-1234.

(31)

สัญลักษณ์ ความหมาย

g แทนนํ าหนักเป็นกรัม

mg แทนนํ าหนักเป็นมิลลิกรัม

^g แทนนํ าหนักเป็นไมโครกรัม

mL แทนปริมาตรเป็นมิลลิลิตร

คําย่อ

EtOAc Ethyl acetate

MeOH Methanol

CH₂Cl₂ Dichloromethane

TLC Thinlayer chromatography

Fr. Fraction

CC Column Chromatography

VG (S)-EA Ethyl acetate extract of twig of Vitex glabrata VG (S)-M Methanol extract of twig of Vitex glabrata

¹H-NMR Proton Nuclear magnetic resonance

(32)

ตาราง 4.1 ผลการทดสอบฤทธิ การต้านเชื อแบคทีเรีย

ส่วนสกัด

MIC (µg/mL)

Streptococcus milleri group Streptococcus mutans ATCC 27175 Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae Streptococcus sobrinus B. subtilis ATCC 26633 B. pertussis C. diptheriae V. cholerae V. paraheamolyticus Streptococcus S. aureus ATCC 29213 S. aureus MRSA 20625 S. areus (MRSA) 20626

ชั นเฮกเซน _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} ชั นเอทิลอะซีเตต _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} ชั นเมทานอล _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200}

(33)

ส่วนสกัด

S. aureus (MRSA) 20627 S. aureus (MRSA) 20628 S. aureus (MRSA) 20630 S. aureus (MRSA) 20631 S. aureus (MRSA) 20632 S. aureus (MRSA) 20633 S. aureus (MRSA) 20635 S. aureus (MRSA) 20636 S. aureus (MRSA) 20652 S. aureus (MRSA) 20653 S. aureus (MRSA) 20654 S. aureus (VRSA) 20622 S. aureus (VRSA) 20623 S. aureus (hVISA) ATCC 700698

ชั นเฮกเซน _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} ชั นเอทิลอะซีเตต _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} ชั นเมทานอล _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200} _{> 200}