บทที3
วิธีการวิจัย
3.1 สารเคมีและเครื่องมือ
3.1.1 วัตถุดิบสําหรับการทดสอบ
มะมวงหาวมะนาวโห สวนมะนาวโหลุงศิริ ต.บางคนที อ.บางนกแขวก จ.สมุทรสงคราม กลีเซอรีนกอนชนิดใส รานฮงฮวด ถ.จักรวรรดิ์ เขตสัมพันธวงศ กรุงเทพมหานคร 3.1.2 จุลินทรียสําหรับการทดสอบ
จากกรมวิทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณะสุข มีดังนี้
แบคทีเรียแกรมลบ ที่ใชในการทดลอง ไดแก
Salmonella typhimurium Escherichia coli
แบคทีเรียแกรมบวก ที่ใชในการทดลอง ไดแก
Staphylococcus aureus Bacillus subtilis
3.1.3 อาหารเลี้ยงเชื้อ 1. Nutrient Agar (NA) 2. Nutrient Broth (NB)
3. Mueller Hinton Agar (MHA) 3.1.4 สารเคมีที่ใชในการทําโครงการวิจัย
1. Sodium chloride (NaCl) 2. 0.5 McFarland Standard 3. 95%Alcohol
3.1.5 อุปกรณใชสําหรับทําสบูกลีเซอรีนผสมน้ําคั้นสดจากผลมะมวงหาวมะนาวโห
1. มีด 2. เขียง 3. ถุงมือ 4. ผาขาวบาง 5. เครื่องบดอาหาร 6. กะละมัง ขนาด 1 ลิตร 7. กระทะไฟฟา
8. เครื่องแกว
3.1.6 อุปกรณที่ใชสําหรับวิเคราะหดานจุลินทรีย
1. จานเลี้ยงเชื้อ 2. หลอดทดลอง
3. กระบอกตวง (Cylinder) 4. Magnetic Bar
5. ชอนตักสาร (Spatula) 6. กระดาษกรอง ขนาด No.1 7. แทงแกวคน (Glass rod)
8. ไมโครปเปต (100 µl -1,000µl , 20 µl -100 µl) 3.1.7 เครื่องมือที่ใชในการทําโครงการวิจัย
1. กลองดิจิตอล (Digital camera)
2. เครื่องเขยาชนิดควบคุมอุณหภูมิ (Shaker) 3. หมอนึ่งฆาเชื้อ (Autoclave)
4. เครื่องชั่ง 2 ตําแหนง (Analytical balance)
ภาพที่ 3.1 ภาพที่เครื่องเขยาชนิดควบคุมอุณหภูมิ(shaker)
ภาพที่ 3.2 หมอนึ่งฆาเชื้อ (Autoclave)
ภาพที่ 3.3 เครื่องชั่ง 2 ตําแหนง (Analytical balance)
3.2 วิธีการทดลอง
3.2.1 วิธีการเตรียมน้ําคั้นสดจากผลมะมวงหาวมะนาวโห
นําผลดิบและผลสุกของมะมวงหาวมะนาวโหมาชั่งอยางละ 100 กรัม จากนั้นนํามาลางน้ําให
สะอาดแลวนํามาผาครึ่งแคะเมล็ดออก นํามาบดหยาบดวยเครื่องบดอาหาร (Moulinex) จากนั้นกรองเอาแตน้ํา แลวนําน้ําคั้นที่ไดมากรองดวยกระดาษกรอง เมื่อกรองเสร็จแลวนํามาใสหลอดปดฝานําไปแชในตู -4°C
ตารางที่ 3.1 ตารางเตรียมน้ําสดแตละสูตรตามอัตราสวนผลดิบตอผลสุก ( 20ml ) สูตร
(ผลดิบ% : ผลสุก%)
น้ําผลดิบ (ml)
น้ําผลสุก (ml) ดิบ100
(100 : 0)
20 -
สุก100 (0 : 100)
- 20
ดิบ75 (75 : 25)
15 5
สุก75 (25: 75)
5 15
ตารางที่ 3.2 ตารางเตรียมน้ําสดแตละความเขมขนตามอัตราสวนน้ําคั้นผลสดตอน้ํากลั่น (10ml ) ความเขมขน
(%)
น้ําสด (ml)
น้ํากลั่น (ml)
100 10 -
75 7.5 2.5
50 5 5
25 2.5 7.5
3.2.2 วิธีการเตรียมอาหาร Nutrient Broth (NB)
ชั่ง Nutrient Broth 6.5 กรัม และตวงน้ํากลั่นปริมาตร 500 มิลลิลิตร ใหความรอนโดยวางบนแทงให
ความรอนพรอมคน จนอาหารละลายหมด นําไปนึ่งเพื่อฆาเชื้อดวย Autoclave ที่ความดัน 15 ปอนดตอตารางนิ้ว อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส เปนเวลา 15 นาที จากนั้นนําอาหารเลี้ยงเชื้อเก็บไวที่อุณหภูมิหอง เปนเวลา 3 วัน เพื่อตรวจสอบการปนเปอนของจุลินทรีย
3.2.3 การเตรียมหัวเชื้อในการทดสอบ
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhimurium และ Bacillus subtilis มาเขี่ย Colony เดี่ยวของเชื้อแตละชนิด จากนั้นนําไปเลี้ยงใหอาหาร Nutrient Broth ปริมาณ 5 มิลลิลิตร นําไปบมที่
อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เขยา 150 รอบตอนาที (rpm) เปนเวลา 16 ชั่วโมง จากนั้นนํามาเปรียบเทียบความ ขุนกับ 0.5Mcland standard เพื่อใหไดเชื้อประมาณ 108 เซลลตอมิลลิลิตร
3.2.4 การหาบริเวณยับยั้งเชื้อกอโรคโดยวิธี Agar well diffusion
1. เตรียมอาหาร Nutrient Agar (NA) ใหความรอนโดยวางบนแทนใหความรอน พรอมกับคนไป ดวย จนอาหารเลี้ยงเชื้อละลายหมด นําไปนึ่งเพื่อฆาเชื้อดวย Autoclave ที่ความดัน 15 ปอนดตอตารางนิ้ว อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส เปนเวลา 15 นาที จากนั้นนํามาวางในอางน้ําอุนที่ อุณหภูมิประมาณ 50 องศา- เซลเซียส
2. ดูดเชื้อจากขอ 3.3.2 ปริมาณ 1000 ไมโครลิตร ลงในอาหาร NA ที่ผานการฆาเชื้อแลว ที่มีอุณหภูมิ
ประมาณ 50 องศาเซลเซียส ผสมใหเขากันโดยเขยาเบาๆเพื่อปองกันการเกิดฟอง เทใสจานเพาะเชื้อ (Petri disc) รอใหวุนแข็งโดยผึ่งในตูปลอดเชื้อ (Biohazard Lamina air flow) เพื่อใหผิวหนาอาหารแหง โดยการเปดฝาจาน เพาะเชื้อทิ้งไวเล็กนอย
3. นําปลายพาสเจอร ปเปตต (Pasteur pipette) ที่นึ่งฆาเชื้อแลว เจาะหลุมบนอาหารแข็ง (จากขอ 2) จานละ 5 หลุม หลังจากนั้น หยดน้ําคั้นสดจากผลมะมวงหาวมะนาวโหแตละความเขมขน (ตามตารางที่ 3.2) ที่
ตองการทดสอบลงในหลุม หลุมละ 20 ไมโครลิตร โดยใชน้ํากลั่นเปนตัวควบคุม จากนั้นนําไปบม 16 ชั่วโมง ที่
อุณหภูมิ
37 องศาเซลเซียส อานผลโดยการวัดขนาดบริเวณใสที่เกิดขึ้นรอบหลุมอาหารเลี้ยงเชื้อ (Inhibition Zone) ดวย เวอรเนียร หรือไมบรรทัด หนวยเปน มิลลิเมตร (mm) ทําการทดลอง 3 ครั้ง ครั้งละ 3 ซ้ํา และรายงานผลเปน คาเฉลี่ย ± สวนเบี่ยงเบนมาตรฐาน
3.3 การทดสอบฤทธิ์การตานเชื้อแบคทีเรียกอโรคของสบูกลีเซอรีน
ทําการทดสอบฤทธิ์การตานเชื้อแบคทีเรียกอโรคของสบูกลีเซอรีนผสมน้ําคั้นสดจากผลดิบและผลสุกของ มะมวงหาวมะนาวโหดวยวิธี Pour-Plate technique
ตารางที่ 3.3 ตารางปริมาณกลีเซอรีนและน้ําสดของแตละสูตรตามอัตราสวนกลีเซอรีน:น้ําคั้นผลสด:น้ํากลั่น
สูตรสบู กลีเซอรีน
(กรัม)
น้ําผลสด (มิลลิลิตร)
น้ํากลั่นฆาเชื้อ (มิลลิลิตร)
Control 90 - 10
ดิบ100% 90 10 -
สุก100% 90 10 -
ดิบ75% 90 10 -
สุก75% 90 10 -
3.3.1 ขั้นตอนการทําสบูกลีเซอรีนใสผสมมะมวงหาวมะนาวโห
ชั่งสบูกลีเซอรีนปริมาณตามตารางที่ 3.3 จากนั้นนํามาหั่นใหมีขนาดเล็กลงเพื่อใหงายตอการละลาย เมื่อหั่นเสร็จนําสบูกลีเซอรีนใสขางตนใสในบีกเกอรแกวขนาด 100 มิลลิลิตร แลวไปหลอใหละลายบนกระทะไฟฟา ที่มีน้ํารอนอุณหภูมิ 50-60 องศาเซลเซียส คนสบูเบาๆไปในทางเดียวกันเพื่อปองกันการเกิดฟอง เมื่อสบูกลีเซอรีน ละลายแลว เติมน้ําคั้นสดแตละสูตรปริมาตรตาม ตารางที่ 3.1 ลงในสบูกลีเซอรีนที่ละลายแลว 10 มิลลิลิตร จากนั้นคนเบาๆ ระวังอยาทําใหเกิดฟอง แลวนํามาเทลงพิมพซิลิโคน ฉีด 95%แอลกอฮอล บนสบูเพื่อไล
ฟองอากาศ จากนั้นรอใหสบูแข็งตัวแลวแกะออกจากพิมพซิลิโคน นํามาบรรจุใสกลองพลาสติก ตารางที่ 3.4 ตารางเตรียมสารละลายน้ําสบูของแตละสูตรตามอัตราสวนสบูตอน้ํากลั่น (10ml)
%ความเขมขน สบู
(กรัม)
น้ํากลั่น (มิลลิลิตร)
0.5% 0.05 9.95
1% 0.1 9.9
3.3.2 การทดสอบฤทธิ์การตานเชื้อแบคทีเรียกอโรคของสบูกลีเซอรีนโดยวิธี Pour Plate
1. เตรียมอาหาร Nutrient Agar (NA) ใหความรอนโดยวางบนแทนใหความรอน พรอม กับคนไปดวย จนอาหารเลี้ยงเชื้อละลายหมด นําไปนึ่งเพื่อฆาเชื้อดวย Autoclave ที่ความดัน 15 ปอนดตอ ตารางนิ้ว อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส เปนเวลา 15 นาที จากนั้นนํามาวางในอางน้ําอุน ที่ อุณหภูมิ
ประมาณ 50 องศาเซลเซียส
2. เตรียมสารละลาย 0.85%NaCl โดย ชั่ง NaCl 4.25 กรัม และตวงน้ํากลั่นปริมาตร 500 มิลลิลิตรนํา NaCl 4.25 กรัม เทผสมกับน้ํากลั่น 500 มิลลิลิตร คนจน NaCl ละลายหมด นําไปนึ่งเพื่อฆาเชื้อดวย Autoclave ที่ความดัน 15 ปอนดตอตารางนิ้ว อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส เปนเวลา 15 นาที จากนั้นนําอาหาร เลี้ยงเชื้อเก็บไวที่อุณหภูมิหอง เปนเวลา 3 วัน เพื่อตรวจสอบการปนเปอนของจุลินทรีย
3. ดูดเชื้อจากขอ 3.4.3 ปริมาตร 1000 ไมโครลิตร (µl) ลงในหลอดที่มี 0.85%NaCl ปริมาตร 9 มิลลิลิตร ที่ผานการฆาเชื้อแลว ตั้งแตลําดับความเจือจาง 10-1 ถึง 10-10 จากนั้นนําเชื้อที่เจือจางแลว ลําดับที่ 10-7 ถึง 10-10 มาทําการทดสอบดวยวิธีการเทเพลท (Pour-Plate) โดยนําอาหารแข็งที่ผานการฆาเชื้อแลว ที่อุณหภูมิ 50 องศาเซลเซียส ปริมาตร 20 มิลลิลิตร แลวเติมสารละลายสบูที่มีความเขมขน 0.5% และ 1% ของ แตละสูตร 200 ไมโครลิตร (µl) เทลงจานเพราะเชื้อที่มีเชื้ออยู 1 มิลลิลิตรจากนั้นผสมใหเขากันเบาๆ ระวังอยาทํา ใหเกิดฟอง ทําทั้งหมด 3 ซ้ํา จากนั้นบมที่อุณหภูมิ 37°C เปนเวลา 16 ชั่วโมง บันทึกผลโดยการนับโคโลนี
(CFU/ml)
