การเฅซยม แอนฝ็เซรุ่ม สาห-รบ เซ-ฐโ ลพลาสรน แระ แอปโตโกลรน ขอV3คน
นา'งสันทรเพชุ บุญค้า
000318
วิทยาฉพนธ์'Ü เป็นส่วนหd'งขอ'งการสืกษาตามหสักสูตร'ปรญญา เภสัชศาสตรมหาฟ้โณ4๒ แผนกจุล'สิววิทยา
ป๋เฬ'๒วิทยาสับ จุฬาถ'งกรถผหาวิทยาสับ พ o ศ. ๒๔๒0
THE PREPARATION OF AMTISERA TO HUMAN CERULOPLASMIN AND HAPTOGLOBIN
Mrs. Chanphen Boonkham
A Thesis Submitted in Partial Fulfillm ent of the Requirements for the Degree of Master of Science in Pharmacy
Department of Microbiology.
Graduate School Chula!ongkorn University
ใ ร 77
นิผ^ฅ
รท
ยาฝัย จุฬาล-งกรณมหารท
ยาร'ยอนุฝัด
ให้นับวิทยานิพนธ์ฉนิบนึ้เป็น ส่วนหส์งของการสืกบาตามหฝักสูตรปจีญฉุทมหานิถ่รf เตไ ^ io:
a o » o o o e o o o 9 # e o o o « c i 0 i » c a o o o « o » o o » o o
(ศาสตราจารย์ ดร. วิศษฐ์ ชระจาบ เหมาะ y
คถ)บด
คณะกรรมการตรวจวิทยานิพนธ์ . . . . ...ประeานกรรมการ (รองศ'โสตราจารย์ ดร. วิเ'ฮยร จีรวงธ์)
h / h f . f f y ? 7 ? f i
5
(ผู้ช่วยศาสตราจารย์ ^สวาท คุดยะ'โพ8) กรรมการ
ff f f
^ ''ร , 0 '1/ / ไ ^)yรV
O O 0^ 0 0 ? ^ o / o 0 0 » » » 10 * 1 0 Ù • </0 0 O O O 0 « o o ท * 0 <5 * • o f t ^ ^ s u m ^ s
(ผู้ช่วยศาสตราจารย์rจุมนา ารรธนะภูด)
อาจารย์ผู้ควบคุมการวิฝัย ะ น.พ. เบญจะ เพชรตลัาย นิฃนิทร์ฃองนิณนิตวิทยาสัย จุฬาลงกรณมหาวิทยาฝัย วิทยานิพนธ์เ^อง
โดย แผนกวิชา
การ เฅจียมแอนด เชจุ่มสาหจีบ เชจุโลพลาสรน และแฮปโตโกลอน ของคน ฝันทร์เพ็ญ บุญค้า
จ ุล อ าวิทยา
iv
'วิโวข้อวิทยางพนธ์ การ เตวิยมแอนวิ เซรุ่ม สาหวิบเซรูโลพลาสรน และแฮปโตโกลป็น ขอ'งคน
นาววิ'นทร์เพ็ณฺ บุญค้า แผนกวิขา^ลง1ววิทยา
อ การสืกษา ๒๕9๙
บทวิ'คย่อ
การ เต?ยม เซ-รูโลพลาสฝ็น และแฮงโ ตโกล งน บวิบุทส์’จากพลาสมา ขอ'งคน โดยใ ช ้ว ิรการแลก เปส่ยนร ออน และ ร'0?แลซ 2 วิ'ม'พรรคภาพ โปรวินบว ิบุทส์ffไ ค ้สด เข้า กระค่าย เต็มวิ'ยใน เวลา ๒-๔ วิ'ปดาห แอนส เซรุ่มfîไค้มาทาใค้รปฎร ว ิยา เฉพาะวิ'บ
โปรสนต็ค้อจการ โดยการดูด'วิ'บค้วย เซรุ่มโปรวิ'น?f เหมาะสม แอนวิเซรุ่มไ!ใข้ตรวจหาระวิบ เซรูโลพลาส อ น และแอปโตโกล งนใน เซรุ่มขอ'งคนไข้โรควิ'บและโรค เฮโมโกล งนฝ็คปรกวิ
พบว่า เซร ูโ ลหลาส อ นใน เซรุ่มคนไข้โรควิมรค่าสูวข้น ส่วนนฮปเตโกล งนในคนไข้โรค เฮโมโกล รนรดปรก8 จะรระวิ'บค่าล'3
Thesis T itle : The Preparation of Antisera To Human Ceruloplasmin and Haptoglobin
Nane : Mrs. Chanphen Boonkham
Department of Microbiology
Academic Year: 197b
ABSTRACT
Purifications of human ceruloplasmin and haptoglobin were employed3 using ion exchange and a ffin ity chromatography. The purified proteins were used to immunize adult rabbits fo r 2 to 4 weeks. The rabbit antisera were made monospecific to respective proteins by iimunoadsorption with suitable serum proteins. The antisera obtained were used in quantitative determinations of serum ceruloplasmin and haptoglobin in patients who suffered from liv e r diseases9 and hemoglobinopathies. Serum ceruloplasmin was increased in case of liv e r diseases. Serum haptoglobin was decreased in case of hemoglobinopathies.
ACKNOWLEDGEMENT
vi
I would lik e to express my deepest appreciation and gratitude to:
Assistant Professor Dr. Bencha Petchclai, Chief C linical Immunology Laboratory, Department of Pathology, riahidol University Faculty of Medicine,Ramathibodi Hospital fo r his supervision, guidance and his encouragement, which as enabled me to carry on this study successfully.
Professor Dr. Prakob Tuchinda, under-secretary of state M inistry of Public Health, my f ir s t advisor, fo r giving me the apporturiity to carry on this study.
Assistant Professor Pisawat Dutiyabodhi, Head of the Department of Microbiology, Chulalongkorn U niversity, Faculty of Pharmaceutical Sciences, fo r her valable advice and permission in conducting this study.
Professor Dr. Natth Bhamarapravati, Head of the Department of Pathology, Mahidol University, Faculty of Medicine fo r his valuable suggestion and permission in conducting this study.
Assistant Professor Sumana Vardhanabhuti, Department of Microbiology, Chulalongkorn University, Faculty of Pharmaceutical Sciences fo r her advice and kindness in correction of tne manuscript.
Associate Professor Vichiara Jirawongse, Head of Department of Pharmacognosy, Chulalongkorn University, Faculty of Pharmaceutical
VI ใ
Sciences, fo r his valuable suggestion.
Dr. Patraporn Issarangkul เ :a Ayudhaya, Department of Pediatric, Mahidol University, Faculty of Medicine, Ramathibodi Hospital, for supplying specimens, which were used in this study.
Hiss Tasanee Cliavanakul ร for supplying Patient's record which was indispensible to this study.
The S taff of Blood bar-king D ivision, Department of Pathology, Hahidol University, Faculty of Medicine, Ramathibodi Hospital in supplying donor blood and outdated plasma.
F inally, I would lik e to express my deepest gratitude to a ll of my friends in C linical Chemistry, Serological and Medical Illu s tra tio n Division, Department of Pathology, Mail idol University Faculty of Medicine, Ramathibodi Hospital for th e ir valuable helps.
Without them, this thesis would not be smoothly finished.
TA’-LL OF CONTENTS
v i i i
Page
THAI ABSTRACT iv
ENGLISH ABSTRACT V
ACKkCULEDGEMEHT vi
LIST OF TABLES X
ABBREVIATIONS xi
LIST OF FIGURES x ii
INTRODUCTION ":v»u ๙** ' 1
Literature Review 3
MATERIALS AND METHODS
Materials 14
Reagents Buffers Animal used
Equipments
M ethods 15
General Method lb
P urification of human serum p r o t e i n 16
Ceruloplasmin 16
haptoglobins 16
Preparation of antisera 20
Preparation of Immunodiffusion plate 21
Serum specimens 21
Determination of ceruloplasmin and haptoglobin
in patients’ sera 22
i x
Page RESULTS
P urification of antigens 24
Ceruloplasmin 24
Haptoglobin 30
Discussion
AND CONCLUSION 43blLLIOGRAPiiY 48
VITA 52
X
Table .
I
IÏ
LIST OF TABLES
Pace Serum ceruloplasmin in normal human and 34 patients with liv e r diseases expressed in
percentage of a standard preparation
Serum haptoglobin in normal human serum 4t and patients with hemoglobinopathies
expressed in percentage of a standard preparation
xi
ABBREVIATIONS
CM-Sepbadex C- 5G =
CNBr CHS Cp Cu+
Cu"+
DEAE-Sephadex A-50 =
Hb HP
Hp~Hb complex =
IgG meg ircl mEq/g
ml =
mol =
M.w.
O.D.
f OS.
P"CN RID
rpm =
Carboxymethyl-Sephadex cation 50 Cyanogen Bromide
Centra] Nervous System ceruloplasmin
cuprous ion cupric ion
Di ethyl ami noethyl“Sepbadex Anion 50
hemoglobin haptog1 obi ท
haptoglobin-hemoglobin complex immunoglobulin Q.
microgram m icro litre
mini equivalent per gram mi ใ 1i 1itre
molecule
molecular weight optical density
Phosphate Buffer Saline Phosphate cyanide
radial immunodiffusion round per minute
x ii
Page Figure 1 The mononuclear copper complex of Ceruloplasmin
molecule study by using Resonance Raman Spectroscopy 5 Figure 2 Elution of ceruloplasmin from CFi-Sephadex column
at the f ir s t run, flow rate of 30 drops/min. 25 Figure 3 Immunoelectrophoresis of protein peaks obtained
from two CM'Sephadex chromatography 26 Figure 4 Rechromatography of ceruloplasmin on CK-Sephadex
column. (Flow rate 36 drops/min.). 27 Figure 5 Ouchterlony double diffusion showing precipitation
of purified ceruloplasmin 26
Figure 6 Immunoelectrophoresis of two fractions obtained
from rechrcmatography on CM-Sephadex column 29 Figure 7 Immunoelectrophcretic comparison between commercial
and prepared anticeruloplasmiท 32
Figure 8 The radial immunodiffusion plate demonstrating
various concentrations of ceruloplasmin 33 Figure 9 Elution of haptoglobin with 3.6 M Urea from
a ffin ity chromatography. 3 4
Figure 10 Double immunodiffusion showing precipitation lines of reaction of prepared haptoglobin 36 Figure 11 Immunoelectrophoresis of prepared haptoglobin 37 Figure 12 Irmiunoelectrophoresls precipitation demonstrating
the p re cip itin lin e of prepared anti-haptoglobin 38 LIST OF FIGURES
Figure 13 Immunoelectrophoretic comparison between
Figure ใ4 Figure 15
commercial and prepared antihaptoglobin 39 Double diffusion showing lines of id e n tity in
p re cip itin reaction 40
'The quantitative determination c f haptoglobin
41 by Radial Immunodiffusion
