ĐỐI KHÁNG VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH TRÊN NGƯỜI CÓ TRONG NƯỚC AO NUÔI TÔM TẠI HUYỆN DUYÊN HẢI,
TỈNH TRÀ VINH
Trần Vũ Phương1, Cao Ngọc Điệp2
ISOLATION AND SELECTION OF ACTINOBACTERIA AGAINST HUMAN PATHOGENIC BACTERIA FROM SHRIMP POND WATER ON DUYEN HAI
DISTRICT, TRA VINH PROVINCE
Tran Vu Phuong1, Cao Ngoc Diep2
Tóm tắt– Phần lớn các quy trình nuôi tôm ở Việt Nam đều có sử dụng kháng sinh. Điều này dẫn tới tình trạng vi khuẩn gây bệnh kháng kháng sinh và ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm khi đưa ra thị trường. Vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn sợi, có khả năng đối kháng vi sinh vật gây bệnh trong nước và có vai trò quan trọng trong việc tạo nhiều chất đối kháng. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm phân lập và tuyển chọn những dòng vi khuẩn sợi có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh trên người từ tám mẫu nước nuôi tôm ở ba địa điểm Ngũ Lạc, Phước Trị, Long Toàn tại huyện Duyên Hải, tỉnh Trà Vinh trên môi trường thạch Gause-1. Kết quả, chúng tôi phân lập được năm mươi ba chủng vi khuẩn sợi. Qua kiểm tra kháng khuẩn đối với chủng vi khuẩn bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch, kết quả có mười hai dòng (chủng) vi khuẩn sợi biểu hiện được khả năng kháng lại vi khuẩn Gram dương như Bacillus cereus và tám dòng (chủng) vi khuẩn sợi biểu hiện được khả năng kháng lại vi khuẩn Gram âm như Escherichia coli. Trong đó, bảy chủng vi khuẩn sợi có khả năng kháng khuẩn tốt là: NL1-1.9, NL1-18a, NL2-2,1b1, NL2-2.2, PT1-1.7a, PT2- 2.8a và LT1-1.1. Các chủng vi khuẩn này được
1,2Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ
Email: [email protected]
xác định thuộc ba chi Streptomyces, Nocardioides, Glutamicibacter.
Từ khóa: kháng vi khuẩn, nước ao tôm, vi khuẩn gây bệnh trên người, vi khuẩn sợi.
Abstract – In the schrimp-farming process at Vietnam has used antibiotic mostly, this leads status of antibiotic resistant bacteria and product do not qualified to the market. Bacteria, especially actinobacteria, had resistantant ability to human pathogenic bacteria in water and they have an im- portant role in sustainable aquaculture. This study aimed to isolate and select good actinobacterial strains against human pathogenic bacteria, from 8 samples of schrimp-pond water at 3 sites Ngu Lac, Phuoc Tri and Long Toan of Duyen Hai district, Tra Vinh province on Gause-1 agar medium. Fifty- three actinobacterial isolates were isolated and 12 isolates were identifed as resistant to Bacillus cereus and 8 isolates were identifed as resistant to Escherichia coli by well-diffusion method. There were 7 isolates had good resistance to select for PCR technique and sequencing and the result were determined 7 these strains: NL1-1.9, NL1- 18a, NL2-2,1b1, NL2-2.2, PT1-1.7a, PT2-2.8a, LT1-1.1 belonged to three genere: Streptomyces, Nocardioides, Glutamicibacter.
Keywords: actinobacteria, antimicrobial, hu-
man pathogenic bacteria, shrimp-pond water.
I. GIỚI THIỆU
Việt Nam có vị trí và điều kiện thuận lợi cho hoạt động thủy sản với đường bờ biển dài hơn 3.260 km, cùng hệ thống sông ngòi, kênh rạch chằng chịt. Việt Nam hầu như đáp ứng khá tốt điều kiện nuôi trồng và đánh bắt thủy hải sản trên toàn quốc. Nuôi trồng thủy sản là một ngành hàng xuất khẩu mũi nhọn của nông nghiệp khi nó có đóng góp lớn trong kim ngạch xuất khẩu chung của toàn ngành. Trong đó, sản lượng nuôi tôm đang tăng đáng kể ở Việt Nam. Tuy nhiên, việc nuôi tôm bị cản trở bởi môi trường nuôi trồng bị ô nhiễm, thức ăn, con giống, đặc biệt là do sự bùng phát dịch bệnh thường xuyên. Tuy việc sử dụng kháng sinh trong nuôi thủy sản nói chung và nuôi tôm nói riêng đã được kiểm tra nghiêm ngặt nhưng sự lạm dụng các chất kháng sinh đã tạo ra những dòng vi khuẩn kháng kháng sinh. Vì thế, nhiều nghiên cứu khác nhau để tìm ra giải pháp cho vấn đề vi khuẩn sợi có khả năng tạo ra kháng sinh đã được thực hiện, nhưng chủ yếu tập trung ở môi trường cạn trong khi môi trường nước vẫn còn hạn chế mà đặc biệt là nước nuôi thủy sản. Mục tiêu của nghiên cứu này là phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sợi có khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh trên người như vi khuẩnB. cereus– vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm do tiết độc tố vào thức ăn - và vi khuẩnE. coli– vi khuẩn gây bệnh đường ruột ở người có trong nước ao nuôi tôm tại huyện Duyên Hải, tỉnh Trà Vinh; qua đó, nghiên cứu tìm kiếm các dòng vi khuẩn sợi có khả năng kháng khuẩn tốt và có tiềm năng để ứng dụng vào y học.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP A. Vật liệu
Tám mẫu nước được thu vào mùa khô tháng 4 năm 2018, vào đầu vụ nuôi tôm tại ba địa điểm:
Long Toàn, Ngũ Lạc và Phước Trị (106o45’29”
đến 106o51’73” Đông và 9o64’37” đến 9o67’88”
Bắc) thuộc thị xã Duyên Hải và huyện Duyên Hải, tỉnh Trà Vinh.
Vi khuẩnBacillus cereus(ATCC 11778) và vi khuẩnEscherichia coli(ATCC 25922) được nhận từ Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy sản
vùng 6 (Địa chỉ: 386C Cách mạng Tháng Tám, phường Bùi Hữu Nghĩa, quận Bình Thủy, thành phố Cần Thơ).
Môi trường Gause-I (Li và Wang, 2009) bổ sung kháng sinh aginalxic kháng vi khuẩn Gram âm (10µg/l) và nystatin kháng nấm (25µg/l) vào môi trường; môi trường Luria Bertani (Sambrook et al., 1989).
B. Phương pháp
1) Thu thập và xử lí mẫu: Mẫu nước được thu ở độ sâu 0,2 m, cách bờ 4 m nhằm đảm bảo không ảnh hưởng bởi tác động ven bờ, trữ lạnh trong thùng xốp với nước đá và vận chuyển về phòng thí nghiệm sau 24 giờ. Mẫu tiếp tục được bảo quản lạnh ở nhiệt độ -40C cho đến khi phân lập vi khuẩn sợi.
2) Phân lập và nuôi cấy vi khuẩn sợi: Mẫu nước nuôi tôm được pha loãng 10 lần, hút 100µL dung dịch đã pha loãng cho vào các đĩa môi trường phân lập (Gause-1) đã chuẩn bị sẵn, dùng que thủy tinh trải đều giọt mẫu trong đĩa, ủ đĩa trong tủ ủ ở nhiệt độ 30oC 10-15 ngày để các vi khuẩn sợi phát triển.
Các đĩa trải mẫu ủ trong tủ vi sinh ở 30oC từ 10 đến 15 ngày xuất hiện nhiều dạng khuẩn lạc khác nhau, chọn các khuẩn lạc khác nhau về màu sắc, hình dạng và kích thước cấy vào các đĩa khác nhau để phân lập và ủ ở 30oC, cấy phân lập nhiều lần trên môi trường cho tới khi quan sát thấy các khuẩn lạc tách rời nhau và đồng nhất, chọn một khuẩn lạc tách rời cấy vào ống thạch nghiêng, ủ ở 30oC cho vi khuẩn sợi phát triển, tiến hành quan sát dưới kích hiển vi ở độ phóng đại 400 lần để kiểm tra độ ròng của vi khuẩn sợi.
Sau khi vi khuẩn ròng trên môi trường, tiến hành đồng thời đo kích thước và quan sát hình thái khuẩn lạc bằng mắt thường gồm các chỉ tiêu như màu sắc, hình dạng, kích thước, độ nổi và dạng bìa.
3) Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn B. cereus và E. coli: Sử dụng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch (well diffusion method) và tiêu chí đánh giá khả năng kháng khuẩn của Galindo (2004), đường kính vòng vô khuẩn được tính theo công thức d = d1 – d2. Trong đó, d là đường kính vòng vô khuẩn, d1 là đường kính tổng vòng vô
khuẩn, d2là đường kính giếng thạch với đối chứng là penicilin (gram dương) và tetracycline (gram âm) (Merk).
4) Nhận diện vi khuẩn sợi: Li trích DNA của vi khuẩn sợi dựa theo phương pháp Sambrook et al.
(1989).
Để nhận diện vi khuẩn sợi, DNA được trải qua hai phản ứng PCR với hai cặp primers: * 27F (5’
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’), 1492R (5’
TACGGTTACCTTGTTACGACTT 3’) và phản ứng PCR theo chu kì như sau: 95oC trong 5 phút, 30 chu kì với tách mạch ở 95oC trong 30 giây, dán mạch ở 55oC trong 30 giây, hoàn tất ở 72oC trong 90 giây và hoàn tất ở 5 phút tại 72oC.
* SC-Act-0235-aS-20 (5’ CGCGGCC- TATCAGCTTGTTG 3’) và SC-Act-0878-aA-19 (5’ CCGTACTCCCCAGGCGGGG 3’) (Sheng et al., 2003) với phản ứng PCR theo chu kì sau:
95oC trong 4 phút, 30 chu kì với tách mạch ở 95oC trong 45 giây, dán mạch ở 68oC trong 45 giây, và hoàn tất ở 72oC trong 1 phút và hoàn tất cuối cùng trong 5 phút ở 72oC.
Giải trình tự các mẫu DNA sau phản ứng PCR ở Công ti TBR (địa chỉ: 533, hương lộ 2, phường Bình Trị Đông, quận Bình Tân, thành phố Hồ Chí Minh). Kết quả giải trình tự các dòng vi khuẩn được so sánh độ tương đồng với các trình tự trên ngân hàng dữ liệu NCBI bằng chương trình BLASTN. Để phân tích cây phả hệ di truyền, các trình tự gen được xử lí với phần mềm CLUSTALX, version 1.81. và phần mềm Mega 7.0 với hệ số bootstrapping 1000 lần cho phân tích Neighbor joining.
5) Xử lí kết quả thí nghiệm: Các kết quả thí nghiệm được xử lí thống kê bằng phần mềm Minitab 16 (ANOVA 1 nhân tố) và vẽ biểu đồ bằng Microsoft Excel 2016.
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN A. Phân lập
Từ tám mẫu nước thu được tại ba địa điểm:
Long Toàn, Phước Trị và Ngũ Lạc của thị xã Duyên Hải và huyện Duyên Hải, tỉnh Trà Vinh, chúng tôi đã phân lập được năm mươi ba dòng vi khuẩn sợi trên môi trường thạch Gause-1 (Bảng 1).
Bảng 1. Các dòng vi khuẩn sợi phân lập được trên môi trường Gause-1
Sau khi ủ ở nhiệt độ 30oC từ 10 đến 15 ngày, các dạng khuẩn lạc xuất hiện với hình dạng, màu sắc, độ nổi, dạng bìa như sau:
Hình dạng khuẩn lạc: 53/53 hình tròn chiếm 100% (Hình 1). Màu sắc khuẩn lạc: 33/53 dòng có màu trắng và trắng đục chiếm 62,3%; 11/53 dòng có màu vàng, vàng nâu và vàng nhạt, chiếm 20,8%; 2/53 dòng có màu xám và đen xám, chiếm 3,7%; 4/53 dòng có màu nâu và nâu nhạt, chiếm 7,5%; 1/53 dòng có màu đỏ, chiếm 1,8%; 1/53 dòng có màu cam, chiếm 1,8% và 1/53 dòng có màu hồng chiếm 1,8%. Dạng bìa của khuẩn lạc:
34/53 dòng có dạng bìa nguyên, chiếm 64,2%;
11/53 dòng có dạng bìa răng cưa, chiếm 20,8%;
8/53 dòng có dạng bìa rễ cây chiếm 9%. Độ nổi của khuẩn lạc: có 12/53 dòng có độ nổi khuẩn lạc dạng mô, chiếm 22,2%; có 42/53 dòng vi khuẩn sợi có độ nổi dạng lài, chiếm 77,8%.
Hình thái tế bào: 17/53 dòng vi khuẩn sợi có hình thái tế bào dạng que, chiếm 32%; 25/53 dòng vi khuẩn sợi có tế bào dạng oval, chiếm 47,2%;
11/53 dòng vi khuẩn sợi có dạng cầu, chiếm 20,8%. Khả năng chuyển động của tế bào: 28/53 dòng vi khuẩn sợi có tế bào chuyển động, chiếm 53,8%; có 25/53 dòng có tế bào không chuyển động, chiếm 47,2%.
Hình 1: Khuẩn lạc các dòng vi khuẩn sợi trên môi trường Gause-1 (NL1.1.8a, NL1.1.9b)
B. Khả năng kháng lại vi khuẩn gây bệnh trên con người
Năm mươi ba dòng vi khuẩn sợi đã phân lập được tiến hành đánh giá khả năng kháng dòng vi khuẩn Bacillus cereus và Escherichia coli bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch sau 24 giờ ủ ở 37oC thu được kết quả chỉ có 20 dòng vi khuẩn sợi kháng lại vi khuẩn Bacillus cereusvà Escherichia coli(Bảng 2).
Trong năm mươi ba dòng vi khuẩn sợi, hai mươi dòng có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh trên con người có vòng vô khuẩn >1 mm, còn ba mươi ba dòng vi khuẩn sợi chỉ biểu hiện kháng vi khuẩn gây bệnh trên con ngưới (cả gram dương và gram âm) không rõ hoặc không kháng theo quy ước của Galindo (2004), khả năng kháng vi khuẩn gây bệnhB. cereus và E. coli của vi khuẩn sợi dòng NL1-1.8a (Hình 2) thể hiện qua vòng vô khuẩn chung quanh giếng.
C. Định danh vi khuẩn sợi
Bảy dòng vi khuẩn sợi có khả năng kháng khuẩn tốt cả vi khuẩn gram dương và vi khuẩn gram âm là: NL1-1.9, NL1-18a, NL2-2,1b1, NL2- 2.2, PT1-1.7a, PT2-2.8a và LT1-1.1. Các dòng vi khuẩn này được chọn để tiến hành phản ứng PCR và giải trình tự. Kết quả định danh trình bày trong Bảng 3.
Hình 3 cho thấy bảy dòng vi khuẩn sợi chia làm hai nhánh (cluster). Nhánh A với bốn dòng gồm hai dòng thuộc chiStreptomyces sp. và hai dòngNocardioides luteus. Nhánh B gồm ba dòng, trong đó có hai dòngGlutamicibacter uratoxydans và một dòng làStreptomyces cyaneofuscatus. Như vậy, bảy dòng vi khuẩn sợi này thuộc về ba chi Streptomyces, Nocardioides và Glutamicibacter.
Trước đây, vi khuẩn sợi (actinobacteria) thường được gọi là xạ khuẩn (actinomycetes) vì chúng có dạng hình sợi rất nhỏ lại có phát triển đồng tâm. Vì vậy, các khoa học cho rằng chúng là thể trung gian giữa nấm và vi khuẩn. Tuy nhiên, nghiên cứu về tế bào học và di truyền học (16S rDNA) xác định chúng là vi khuẩn (Pandey et al., 2004). Từ khi phát minh ra actinomycin (Lecheva- lier, 1982), vi khuẩn sợi (actinobacteria) được biết đến là loài sinh vật sản xuất hợp chất sinh
học có tính kháng khuẩn và kháng ung thư được thương mại hóa và sản xuất enzymes công nghiệp (Tanaka and Omura, 1990), có khoảng trên 650 kháng sinh tự nhiên được phân lập từ sinh vật này (Takaizawa et al., 1993). Trong số chúng, nhiều sản phẩm nhận từStreptomyces(Goodfellow and O’Donnell, 1989) và những sản phẩm tự nhiên này được trích li để phát triển thành thuốc hay dược phẩm mới.
Trong những năm gần đây, người ta biết đến giá trị của lớp phù sa biển (marine sediments) như là nguồn vi khuẩn sợi phong phú sản xuất nhiều sản phẩm thứ cấp hữu dụng (Goodfellow and Haynes, 1984). Goodfellow and Haynes (1984) tổng kết báo cáo phân lập vi khuẩn sợi ở lớp phù sa biển này có nhiều loài vi khuẩn sợi mới với nhiều sản phẩm thứ cấp hữu dụng hơn. Dharmaraj (2010) cho rằng Streptomyces biển xuất hiện ở nhiều nguồn sinh học khác nhau như cá, ốc, hải miên, rong biển và rừng ngập mặn, trong đó có cả nước biển và phù sa. Theo Sivakumar et al. (2007) ở bán đảo Ấn Độ, họ phát hiện 41 loài vi khuẩn sợi thuộc tám chi trong đó chi Streptomyces là chi xuất hiện rất nhiều, ở chín bang ven biển của Ấn Độ chỉ có bốn bang là nghiên cứu nhiều về vi khuẩn sợi. Kháng sinh từ vi khuẩn sợi gốc biển là nguồn và tiềm năng quan trọng về hợp chất sinh học mới (Colwell and Hill, 1992), bởi vì điều kiện môi trường biển khắc nghiệt, khác với điều kiện bình thường, mà chúng sản xuất được nhiều loại kháng sinh mới (Adinarayana et al., 2006). Kháng sinh được phân lập thường mới so với những loại đã biết trước đây (Meiying and Zhicheng, 1998).
Chúng tôi tìm ra dòng vi khuẩn sợi kháng cả vi khuẩn gram dương lẫn vi khuẩn gram âm như dòng NL1-1.8a và hi vọng sẽ trích ra những hoạt chất xác định cấu trúc tính kháng khuẩn của chúng bằng phương pháp GC-MS.
Bảng 2. Khả năng kháng lại vi khuẩn của 20 dòng vi khuẩn sợi (thể hiện qua vòng vô khuẩn)
Hình 2: Khả năng kháng vi khuẩnB. cereus(a) và E. coli(b) của vi khuẩn sợi dòng NL1-1.8a
Bảng 3. Kết quả định danh bảy dòng vi khuẩn sợi
Hình 3: Cây phả hệ trình bày mối quan hệ giữa bảy dòng vi khuẩn sợi được phân tích theo phương pháp UPGMA với hệ số boostrap là 1000
IV. KẾT LUẬN
Chúng tôi phân lập được năm mươi ba dòng vi khuẩn sợi, xác định mười hai dòng có tính kháng lại vi khuẩn Gram dương và tám dòng có tính
kháng lại vi khuẩn Gram âm, trong đó có dòng kháng mạnh như dòng NL1-1.8a, tương đương với kháng sinh penicillin và tetracycline.
Chúng tôi nhận diện bảy dòng vi khuẩn sợi:
NL1-1.9, NL1-18a, NL2-2.1b1, NL2-2.2, PT1- 1.7a, PT2-2.8a và LT1-1.1. Các dòng này thuộc về ba chiStreptomyces, Nocardioides và Glutami- cibacter.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Li Q and Wang G, 2009. Diversity of fungal isolates from three Hawaiin marine sponges.Microbiol Res.
164: 231-235.
[2] Sambrook J, Fritsch EP, and Manlatis T, 1989. In vitro amplification of DNA by the polymerase chain reaction. In: Molecular cloning. A Laboratory Man- ual 2nd edn. New York: Cold Spring Habor Labora- tory Press. 14: 2 - 35.
[3] Galindo AB, 2004.Lactobacillus plantarum 44A as a live feed supperlement for freshwater fish. Ph.D Thesis. pp: 1-131.
[4] Sheng Q, Wen-Jun L, Syed GD, and Wael NH, 2003.
New primers for the class Actinobacteria: Applica- tion to marine and terrestrial environments.Applied and Environmental Microbiology. 75(19): 6176-86.
[5] Pandey B, Ghimire P, and Agrawal VP, 2004. Stud- ies on the antibacterial activity of the actinomycetes isolated from the Khumbu region of Nepal.Acad Sci Technol. 4(3):1-4.
[6] Lechevalier H, 1982. The development of applied microbiology at Rutgers, The State University of New Jersay.
[7] Tanaka Y and Omura O, 1990. Metabolisms and products of actinomycetes – An Introduction.Actino- mycetologica4:13–14
[8] Takaizawa M, Colwell W and Hill RT, 1993. Isolation and diversity of actinomycetes in the Chesapeake Bay.Appl Environ Microbiol. 59:997–1002
[9] Goodfellow M and O’Donnell AG, 1989. Roots of Bacterial Systematic. In: The Handbook of new bac- terial systematic. Academic Press, London. pp 3–54 [10] Goodfellow M and Haynes JA, 1984.Actinomycetes
in marine sediments. In: Biological, biochemical and biomedical aspects of actinem (Ortiz-Ortiz I, Bojalil LF & Yakoleff V eds). Academic Press, London. pp 453-472
[11] Dharmaraj S, 2010. Marine Streptomyces as a novel source of bioactive substances. Review.
World J Microbiol Biotechnol. 26:2123-213 DOI 10.1007/s11274-010-0415-6
[12] Sivakumar K, Kumar M.S, Thangaradjou T, and Kan- nan L, 2007.Research on marine actinobacteria in India. J. Microbiol. 47:186–196
[13] Colwell RR and Hill RT, 1992.Microbial diversity.
In: Diversity of Oceanic Life: An Evaluative Review (Peterson MNA ed). The Centre for Strategic and International Studies, Washington, DC. pp 100-106 [14] Adinarayana G, Venkateshan MR, Bapiraju VV, Su-
jatha P, Premkumar J, Ellaiah P, and Zeeck A, 2006.
Cytotoxic com-pounds from the marine actinobac- terium. Bioorg Khim. 32: 328-334
[15] Meiying Z and Zhicheng Z, 1998. Identification of marine actinomycetes S-216 strain and its biosyn- thetic conditions of antifungal antibiotic. J Xiamen Univ Nat Sci. 37:109-114
