ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁ RÔ ĐỒNG (ANABAS TESTUDINEUS) Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG DỰA TRÊN GENE AQUAPORIN 1aa
GENETIC DIVERSITY OF THE CLIMBING PERCH (ANABAS TESTUDINEUS) IN THE MEKONG DELTA BASED ON AQUAPORIN 1aa GENE
TRƯƠNG THẾ QUANG
TS. Trường Đại học Văn Lang, [email protected], Mã số: TCKH25-09-2021
TÓM TẮT: Tách chiết và thu nhận được DNA tổng số của 15 mẫu cá rô đồng (Anabas testudineus) tại các vùng có độ mặn khác nhau ở Đồng bằng sông Cửu Long. Thiết kế và sàng lọc thu được cặp mồi đặc hiệu DNA/Aqp1-f và DNA/Aqp1-r để khuếch đại gene AQP1aa bằng kỹ thuật PCR. Giải trình tự, ráp nối và chú thích thành công gene AQP1aa. Kết quả so sánh quan hệ di truyền và đa dạng di truyền giữa các nhóm loài cá rô đồng dựa trên gene AQP1aa, nhóm 4 và nhóm 5 có khác biệt đa dạng di truyền cao nhất (k45 = 4,800; D45 = 0,01026), nhóm 1 và nhóm 2 có khác biệt đa dạng di truyền thấp nhất (k12= 0,571; D12 = 0,00127).
Từ khóa: cá rô đồng; quan hệ di truyền; đa dạng di truyền; gene Aquaporin 1aa.
ABSTRACT: We extracted and obtained a total DNA of 15 climbing perch samples (Anabas testudineus) in different salinity zones in the Mekong Delta. Primer pairs DNA/Aqp1-f and DNA/Aqp1- r have been designed and screened to amplify the AQP1aa gene using PCR techniques. We successfully sequenced, assembled and annotated AQP1aa gene. Results of comparing genetic relationships and genetic diversity between groups of climbing perch based on AQP1aa gene show that group 4 and group 5 had the highest genetic diversity difference (k45 = 4.800, D45 = 0.01026), group 1 and group 2 had the lowest genetic diversity difference (k12 = 0.571, D12 = 0.00127).
Key words: climbing perch; genetic relationship; genetic diversity; aquaporin 1aa gene.
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Nghề nuôi cá rô đồng (Anabas testudineus) mang lại hiệu quả kinh tế khá cao cho người dân, cá rô đồng là loại cá ngắn ngày, cho thu hoạch nhanh và thu lợi nhuận cao. Hiện nay, ở Đồng bằng sông Cửu Long nhiều hộ dân chuyển sang nuôi giống cá rô đồng ngắn ngày chỉ từ 4 đến 5 tháng, áp dụng tốt các kỹ thuật, việc thu hoạch cá rô đồng đạt trọng lượng trung bình từ 10 đến 15 con/kg và cho năng suất từ 3 đến 5 tấn/1000 m2. Trong những năm gần đây, tình hình nuôi trồng thủy sản ở Đồng bằng sông Cửu Long gặp phải khó khăn, đặc biệt là tình trạng xâm nhập mặn vào các vùng nuôi cá nước ngọt ngày càng tăng do biến đổi khí hậu khiến
việc nghiên cứu tìm ra giống cá mới có khả năng thích nghi tốt, phát triển bình thường và có giá trị kinh tế cao ở môi trường nước lợ, nước mặn là việc trăn trở của các nhà khoa học thủy sản [2, tr.55].
Gene Aquaporin 1aa (AQP1aa) mã hóa cho lớp màng protein chịu trách nhiệm điều chỉnh lượng nước ra vào tế bào để đáp ứng với sự thay đổi áp suất thẩm thấu [4, tr.1-14].
Chúng có khả năng kiểm soát sự cân bằng của muối và giữ vai trò quan trọng trong việc lọc nước cho thận. Ở cá rô đồng, AQP1aa biểu hiện cao nhất trong mang và da. AQP1aa ở cá rô đồng có vai trò sinh lý lớn trong việc giữ nước, bài tiết muối và điều hòa áp suất thẩm
thấu. Nghiên cứu đa dạng di truyền cá rô đồng ở Đồng bằng sông Cửu Long dựa trên AQP1aa để đánh giá đa dạng di truyền, nhận biết giống chọn lọc các tính trạng năng suất, phẩm chất và khả năng chống chịu sự nhiễm mặn của môi trường là thực sự cần thiết trong công tác chọn giống hiện nay.
2. MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Mục tiêu nghiên cứu tìm ra mối quan hệ di truyền và đa dạng di truyền các dòng cá rô đồng (Anabas testudineus) sống tại các vùng nước có độ mặn khác nhau ở Đồng bằng sông Cửu Long. Nhận diện các dòng cá rô đồng chịu mặn ở Đồng bằng sông Cửu Long bằng các tham số đa dạng di truyền dựa trên gene AQP1aa.
Nội dung nghiên cứu tách chiết DNA tổng số (total deoxyribonucleic acid)từ mô thịt cá rô đồng sống ở các vùng có độ mặn khác nhau tại Đồng bằng sông Cửu Long, thiết kế “cặp mồi (primers)” và khuếch đại gene AQP1aa bằng kỹ thuật PCR. Phân tích quan hệ di truyền và đa dạng di truyền các dòng cá rô đồng sống ở các vùng có độ mặn khác nhau tại Đồng bằng sông Cửu Long dựa trên gene AQP1aa.
3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Mẫu vật thí nghiệm
Cá rô đồng (Anabas testudineus) được lấy từ các vùng nước có độ mặn khác nhau ở Đồng bằng sông Cửu Long. Các mẫu cá sau khi bắt được bảo quản trong túi chứa mẫu ở điều kiện 4
oC để thực hiện các bước nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Tách chiết và kiểm tra chất lượng DNA tổng số Các mẫu cá rô đồng sau khi vận chuyển đến phòng thí nghiệm, được bảo quản trong điều kiện nhiệt độ 70 oC cho đến khi tiến hành tách chiết DNA tổng số. DNA tổng số được trích ly từ mô thịt cá bằng bộ kit PHUSA- IHHNV theo quy trình của Công ty Sinh hóa Phù Sa. Dung dịch DNA tổng số tinh sạch có tỷ số OD260nm / OD280nm nằm trong khoảng từ 1,8 đến 2; nếu tỷ số OD260nm / OD280nm > 2 thì dung dịch DNA bị biến tính hoặc phân hủy, nếu tỷ số
OD260nm / OD280nm < 1,8 thì dung dịch DNA có lẫn tạp chất.
3.3. Khuếch đại và giải trình tự gene AQP1aa Sử dụng phần mềm tin sinh học trên hệ thống “NCBI (National Center for Biotechnology Information)” bằng công cụ Primer - Blast thiết kế các cặp mồi khuếch đại gene AQP1aa bằng kỹ thuật PCR. Sau khi chạy PCR khuếch đại trình tự gene AQP1aa, tiến hành điện di trên gel agarose 2% để kiểm tra chất lượng và tinh sạch sản phẩm PCR. Band sản phẩm PCR phải sáng rõ, chiều rộng của band lớn và có kích thước khoảng 780 bp thì xem như phản ứng khuếch đại thành công. Sản phẩm PCR sau khi thu nhận sẽ được giải trình tự cả hai chiều (chiều xuôi và chiều ngược) bằng phương pháp Sanger trên hệ thống máy ABI 3130 (Applied Biosystem, USA).
3.4. Xây dựng cây phát sinh loài
Cây phát sinh loài là sơ đồ thể hiện mức độ tương đồng giữa các trình tự qua quá trình tiến hóa di truyền. Lập ma trận khoảng cách di truyền giữa các nhóm loài theo mô hình Kimura 2 - parameter và xây dựng cây phát sinh loài theo thuật toán Neighbor – Joining Tree [1, tr.201-215], ứng dụng các công cụ thuộc phần mềm Mega X [5, tr.1547-1549].
Chọn khởi tạo với bootrap 1.000 lần lặp lại để tăng độ tin cậy tính toán.
3.5. Phân tích phát sinh chủng loài
Phân tích phát sinh chủng loài được thực hiện dựa trên sắp hàng nhiều trình tự gene AQP1aa của các dòng cá rô đồng chịu mặn và trình tự gene AQP1aa đối chứng được thu thập từ cơ sở dữ liệu GenBank theo thuật toán ClustalW [5, tr.162-164], ứng dụng phần mềm Mega X.
3.6. Phân tích quan hệ di truyền và đa dạng di truyền
Dựa vào cây phát sinh loài, phân loại nhóm loài sao cho khoảng cách di truyền giữa các nhóm Dij DCP. Từ đó, xác định các nhóm có khoảng cách di truyền xa, trung bình và gần.
Ứng dụng phần mềm DnaSP 6.12.01 phân tích
các tham số đa dạng di truyền trong sắp hàng hai trình tự gene AQP1aa của các nhóm cá rô đồng.
3.7. Phân tích thống kê
Kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình mẫu. Xử lý số liệu, so sánh các giá trị trung bình mẫu bằng phương pháp phân tích phương sai (Anova) với độ tin cậy 95%.
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Lấy mẫu
Các mẫu cá rô đồng (Anabas testudineus) được thu thập từ năm vùng có độ mặn khác nhau ở Cần Thơ, Bến Tre, Vĩnh Long, Long An, Tiền Giang vào tháng 18-04-2019 (Bảng 1).
Bảng 1. Số lượng mẫu cá rô đồng (Anabas testudineus)
STT Tên mẫu Độ
mặn
Số lượng 1 Anabas testudineus
Cần Thơ 0,1 ppt 3
2 Anabas testudineus
Bến Tre 0,3 ppt 3 3 Anabas testudineus
Vĩnh Long 1,0 ppt 3 4 Anabas testudineus
Long An 3,0 ppt 3
5 Anabas testudineus
Tiền Giang 4,0 ppt 3 4.2. Kết quả tách chiết DNA tổng số
Kết quả tách chiết DNA tổng số của 15 mẫu cá rô đồng (Anabas testudineus) có hiệu chỉnh phù hợp với thực tế của mẫu. Kết quả thu được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 2%.
Điện di dùng để xác định độ tinh sạch, nguyên
vẹn của DNA. Kết quả điện di trên gel agarose cho thấy các band DNA thu được từ cá mẫu cá rô đồng đều có band đậm, sáng rõ.
Kết quả đo tỷ số OD260nm / OD280nm của các mẫu cá rô đồng đều nằm trong khoảng từ 1,8 đến 2,0 (Bảng 2). Điều này cho thấy DNA tổng số tách chiết có nồng độ và độ tinh sạch khá cao không lẫn tạp chất protein và các phân tử hữu cơ khác.
Bảng 2. Kiểm tra chất lượng DNA tổng số bằng kỹ thuật OD
STT Tên mẫu OD260nm /
OD280nm
1 Anabas testudineus Cần Thơ a 1,86 2 Anabas testudineus Cần Thơ b 1,82 3 Anabas testudineus Cần Thơ c 1,89 4 Anabas testudineus Bến Tre a 1,90 5 Anabas testudineus Bến Tre b 1,93 6 Anabas testudineus Bến Tre c 1,91 7 Anabas testudineus Vĩnh Long a 1,85 8 Anabas testudineus Vĩnh Long b 1,87 9 Anabas testudineus Vĩnh Long c 1,90 10 Anabas testudineus Long An a 1,82 11 Anabas testudineus Long An b 1,83 12 Anabas testudineus Long An c 1,86 13 Anabas testudineus Tiền Giang a 1,88 14 Anabas testudineus Tiền Giang b 1,82 15 Anabas testudineus Tiền Giang c 1,84
4.3. Cặp mồi khuếch đại gene AQP1aa bằng kỹ thuật PCR
Dựa trên kết quả sàng lọc đã thiết kế được cặp mồi đặc hiệu dùng để chạy PCR khuếch đại gene AQP1aa (Bảng 3).
Bảng 3. Cặp mồi sử dụng khuếch đại trình tự gene AQP1aa [3, tr.39]
Tên mồi Trình tự mồi 5’- 3’ Tm (oC) Chiều phản ứng
DNA/Aqp1-f CAAGAACTTCTGGAAGGCCG 58,84 Xuôi
DNA/Aqp1-r ATAATCGCCCACTGGACCAC 59,32 Ngược
4.4. Đa dạng di truyền cá rô đồng dựa trên gene AQP1aa
Sau khi giải trình tự hai chiều bằng hệ thống máy ABI 3130, hiệu chỉnh hai đầu 5’ và 3’ của trình tự bằng phần mềm GENtle phiên bản 1.9.4 và công cụ nucleotide BLAST
(NCBI) ta thu được các trình tự gene AQP1aa của các mẫu cá rô đồng. Trình tự gene AQP1aa hoàn chỉnh có kích thước 786bp thu được từ cá rô đồng đã được GenBank cấp mã số gia nhập (Accession Number) MT012828 và phát hành ngày 07-06-2020, mã hóa cho AQP1aa với 261
amino acid, có khối lượng phân tử là 27,4 kDa (Hình 1) [6], [7], [8].
Hình 1. Trình tự AQP1aa của cá rô đồng đã được GenBank cấp mã số gia nhập MT012828 và phát hành [2, tr.60]
Kết quả sắp hàng nhiều trình tự gene AQP1aa của các mẫu cá rô đồng bằng phần mềm Mega X thiết lập được ma trận khoảng cách di truyền giữa các nhóm và cây phát sinh loài.
4.4.1. Khoảng cách di truyền giữa các nhóm cá rô đồng dựa trên gene AQP1aa
Ứng dụng phần mềm Mega X, sắp hàng 16 trình tự AQP1aa của cá rô đồng bằng thuật toán ClustalW. Kết quả thiết lập được ma trận khoảng cách di truyền giữa các nhóm cá rô đồng theo mô hình Kimura 2 - parameter với bootstrap 1000 lần lặp lại để tăng độ tin cậy (Bảng 4). Với điều kiện khoảng cách di truyền
giữa các nhóm Dxy 0,00127 các loài cá rô đồng sống ở những vùng có độ mặn khác nhau tại Đồng bằng sông Cửu Long được phân làm 5 nhóm: Nhóm 1 (Group 1): Cá rô đồng Cần Thơ và đối chứng; Nhóm 2 (Group 2): Cá rô đồng Bến Tre; Nhóm 3 (Group 3): Cá rô đồng Vĩnh Long;
Nhóm 4 (Group 4): Cá rô đồng Long An; Nhóm 5 (Group 5): Cá rô đồng Tiền Giang. Căn cứ khoảng cách di truyền giữa các nhóm cá rô đồng sống ở Đồng bằng sông Cửu Long dựa trên gene AQP1aa (Bảng 4), nhóm 4 và nhóm 5 có khoảng cách di truyền xa nhất 0,01026; nhóm 1 và nhóm 2 có khoảng cách di truyền gần nhất 0,00127.
Bảng 4. Khoảng cách di truyền giữa các nhóm cá rô đồng dựa trên gene AQP1aa [3, tr.50]
Tên nhóm Vùng sống (độ mặn) Nhóm 1 Nhóm 2 Nhóm 3 Nhóm 4 Nhóm 5 Nhóm 1 Cần Thơ (0,1 ppt)
Nhóm 2 Bến Tre (0,3 ppt) 0,00127
Nhóm 3 Vĩnh Long (1,0 ppt) 0,00262 0,00393
Nhóm 4 Long An (3,0 ppt) 0,00383 0,00511 0,00657
Nhóm 5 Tiền Giang (4,0 ppt) 0,00639 0,00768 0,00393 0,01026 4.4.2. Cây phát sinh loài của các nhóm cá rô
đồng dựa trên gene AQP1aa
Phân tích phát sinh chủng loài (Hình 2) được thực hiện dựa trên sắp hàng nhiều trình tự gene AQP1aa của các dòng cá rô đồng (Anabas testudineus) sống ở các vùng có độ mặn khác nhau tại Đồng bằng sông Cửu Long theo thuật toán Neighbor - Joining Tree, ứng dụng phần mềm Mega X. Độ tin cậy của cây phát sinh loài được xây đựng từ 16 trình tự và được đánh giá bằng phân tích bootstrap với 1000 lần lặp lại.
4.4.3. Đa dạng di truyền giữa các nhóm cá rô đồng dựa trên gene AQP1aa
Kết quả so sánh đa dạng di truyền giữa hai nhóm loài (Bảng 5 và Hình 3), nhóm 4 và nhóm 5 có khác biệt đa dạng di truyền cao nhất (k45 = 4,800; D45 = 0,01026). Nhóm 1 và nhóm 2 có khác biệt đa dạng di truyền thấp nhất (k12= 0,571;
D12 = 0,00127). Kết quả này cũng phù hợp với phân tích quan hệ di truyền giữa hai nhóm loài theo khoảng cách di truyền đã nêu ở mục 4.4.1.
Hình 2. Cây phát sinh loài của một số dòng cá rô đồng dựa trên gene AQP1aa [3, tr.50]
Bảng 5. Các tham số đa dạng di truyền giữa các nhóm cá rô đồng dựa trên AQP1aa [3, tr.59]
Tên nhóm
Tổng số trình tự của
hai nhóm
Số vị trí SNP
Số vị trí SNP trung
bình (kij)
Tham số đa dạng di truyền (Pi)
Số vị trí đột biến giữa hai nhóm
trung bình
Tham số khác biệt đa dạng di truyền giữa hai nhóm (Dij)
Nhóm 1 - Nhóm 2 7 1 0,571 0,00073 1,000 0,00127
Nhóm 1 - Nhóm 3 7 2 1,143 0,00149 2,000 0,00261
Nhóm 1 - Nhóm 4 7 3 1,714 0,00218 3,000 0,00382
Nhóm 1 - Nhóm 5 7 5 2,857 0,00364 5,000 0,00636
Nhóm 2 - Nhóm 3 6 3 1,800 0,00235 3,000 0,00392
Nhóm 2 - Nhóm 4 6 4 2,400 0,00305 4,000 0,00509
Nhóm 2 - Nhóm 5 6 6 3,600 0,00458 6,000 0,00763
Nhóm 3 - Nhóm 4 6 5 3,000 0,00392 5,000 0,00654
Nhóm 3 - Nhóm 5 6 3 1,800 0,00235 3,000 0,00392
Nhóm 4 - Nhóm 5 6 8 4,800 0,00611 8,000 0,01026
Hình 3. Đồ thị so sánh các tham số đa dạng di truyền kij, Dij giữa các nhóm cá rô đồng dựa trên AQP1aa
5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận
Tách chiết và thu nhận được DNA tổng số của 15 mẫu cá rô đồng (Anabas testudineus) tại các vùng có độ mặn khác nhau ở Đồng bằng sông Cửu Long. Thiết kế và sàng lọc thu được cặp mồi đặc hiệu DNA/Aqp1-f và DNA/Aqp1-r khuếch đại gene AQP1aa bằng kỹ thuật PCR.
Giải trình tự, ráp nối và chú thích thành công gene AQP1aa.
Kết quả so sánh đa dạng di truyền giữa các nhóm cá rô đồng dựa trên gene AQP1aa, nhóm 4 (Long An 3,0 ppt) và nhóm 5 (Tiền Giang 4,0 ppt) có khác biệt đa dạng di truyền cao nhất (k45
= 4,800; D45 = 0,01026). Nhóm 1 (Cần Thơ 0,1
ppt) và nhóm 2 (Bến Tre 0,3 ppt) có khác biệt đa dạng di truyền thấp nhất (k12= 0,571; D12 = 0,00127). Kết quả này cũng phù hợp với phân tích quan hệ di truyền giữa các nhóm cá rô đồng theo khoảng cách di truyền đã nêu ở mục 4.4.1.
5.2. Kiến nghị
Bài viết mở rộng mức độ biểu hiện của các gene AQP1, AQP1a, AQP1b, AQP1ab cũng như cơ chế vận chuyển Na+/K+-ATPase, Na+: K+: 2Cl- cân bằng nội mô. Khảo sát khả năng chịu mặn của một số dòng cá rô đồng dựa trên các gene AQP1 để chọn giống cá rô đồng có khả năng chịu mặn cao và ứng dụng nuôi trong môi trường nước lợ ở Đồng bằng sông Cửu Long.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Trương Thế Quang (2018), Tin sinh học (Bioinformatics), Nxb Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
[2] Trương Thế Quang và Huỳnh Ngọc Mỹ Phương (2020), Biểu hiện gene Aquaporin 1 (AQP1) trên cá rô đồng (Anabas testudineus) nuôi thử nghiệm trong nước mặn, Tạp chí Khoa học Đại học Văn Lang, số 21.
[3] Trương Thế Quang và Huỳnh Ngọc Mỹ Phương (2020), Đa dạng di truyền và biểu hiện chịu mặn của cá rô đồng (Anabas testudineus) sống ở Đồng bằng sông Cửu Long dựa trên gene Aquaporin 1aa (Aqp1aa), Trường Đại học Văn Lang.
[4] Ip Y., Soh M., Chen X., Ong J., Chng Y. & Ching B. (2013), Molecular characterization and mRNA expression of aquaporin 1 in the climbing perch, Anabas testudineus, exposed to freshwater, seawater, terrestrial conditions or environmental ammonia, PLoS One, 8(4).
[5] Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C. & Tamura K. (2018), MEGA X: molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms, Molecular biology and evolution, 35(6).
[6] Truong The Quang and Huynh Ngoc My Phuong (2020), Anabas testudineus aquaporin 1 (aqp1) mRNA, complete cds, Accession MT012828, GenBank, National Center for Biotechnology Information (NCBI), USA, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MT012828.
[7] Truong The Quang and Huynh Ngoc My Phuong (2020), Expression of the aquaporin 1 (aqp1) mRNA in the gills of the brackishwater climbing perch (Anabas testudineus), European Nucleotide Archive, London, England, https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/MT012828.
[8] Truong The Quang and Huynh Ngoc My Phuong (2020), Anabas testudineus aquaporin 1 (aqp1) mRNA, complete cds, Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan, http://ddbj.nig.ac.jp/arsa/search?lang=en&cond=quick_search&operator=AND&query=MT012828.
Ngày nhận bài: 17-12-2020. Ngày biên tập xong: 02-01-2021. Duyệt đăng: 22-01-2021
