ting NGOAI HIEU NANG CAO, TAO CHAT vA DUNG TICH VET CUA TRONG TUONG

(1)

THONG TIN KHOA HOC - TIN TlfC

PHAN TICH VET CUA TOBRAMYCIN TRONG HUYET TUONG NGUdi

B A N G S A C KY L O N G

HIEU NANG CAO, TAO

D A N

CHAT vA SLT DUNG DETECTOR TO NGOAI

Chia-Hsien Feng, Shun-Jin Lin, Hsin-Lung Wu, Su-Hwei Chen (Journal of Chromatography B, 780 (2002) 349-354)

Ngudi lupc dich: TRAN THUY HANH Vien Kiem nghiem thudc TW

1, Dat van de

Tobramycin, mdt khang sinh nhdm aminoglycosid, thudng dugc chi dinh dung dudng tiem tmyen de dieu tri cac nhidm trung true khuin gram am nang. Hoat tmh khang khuIn cua tobramycin dugc thuc hien bing each gin kdt khdng thuan nghich vdi cac tieu don vi 30S va 50S cua ribosom, ket qua tao thanh mdt protein khiem khuyet.

Gidng nhu cic aminoglycosid khac, tobramycin cd khoang ndng do an loan dieu tri hep (KJioang chdnh lech giua ndng do dinh va ndng do day trong khoang ndng do dieu tri cua tobramycin trong huyet tuong).

Ndng do dieu tri trong huyet tuong cua tobramycin nim trong khoang 4 - 8mg/l vl cd the gay ra ddc tfnh nghidm trgng tren tai va than vdi mdt lieu phap dieu tri dai ngay. Do dd viec kiem tra ndng do tobramycin trong huyet tuong thudng dugc yeu ciu de kiem soat lieu phap dieu tri va mflc do ddc tfnh.

De do ndng do tobramycin, ngudi ta thudng dung phuang phap dinh lugng miin dich, quang phd va sic ky. Dinh lugng midn dich huynh quang phan cue (FPIA) va HPLC la cic ky thuat dugc sfl dung nhieu nha't de phan tfch tobramycin trong nhieu chat nen khac nhau. Trong FPIA, ddi khi xay ra phan ung cheo vl thudc thfl lai rit dit. Phuong phap dinh lugng midn dich cung khdng thich hgp de xlc dinh su cd mat cua cic san phim phan huy hoac tap chat.

ca'u true cua tobramycin (hinh 1) chi ra ring tobramycm cd 5 nhdm amin bac nhat, 1 nhdm OH bac nha't va 4 nhdm OH bac hai. Do cd nhdm mang mau yeu trong phan tfl, phuong phap HPLC dinh lugng true tiep tobramycin khdng di thuc hien. Ngudi ta thudng tao din chat de lam tang do hap thu UV cua phan tfl tobramycin. Thudc thfl tao din chat thudng dung la: 3,5-dinitrobenzoyl clorid, l-fluoro-2,4- dinitrobenzen, acid 2,4,6-trinitrobenzen sulfonic, va o-phthalaldehyd. Tuy nhidn, viec tao din chat vdi cac thudc thfl nay thudng tao ra cac din chat khdng ben

hoac qui trinh tie'n hanh phflc tap. Tobramycin co ehfla nhieu nhdm ehflc trong phan tfl. De lam tang d6 nhay phat hidn va thu dugc mdt din cha't ben vflng, cic nhdm mang mau dugc tao thanh tren cac nhom amin bac nhat qua mdt tac nhan tao din chat. Phan ung xay ra dudi cac dieu kien thudng de trinh su thiiy phan va/ hoac su phan huy cua phan tfl. Do tren thuc te cac nhdm amin bac nha't cd the dugc gin kei voi isothiocyanat de tao thanh mdt din chit isothioure bdn vung, ndn 1-naphthyl isothiocyanat (MTC) dugc chon nhu la tic nhan tao din chat.

t o b r a n u c i n

N=C=S

NHR

1- naphlhyl isoIhioi.-\an;u

Hinh 1. Phdn ting kit hap giUa tobramycin vd NTTC.

Trong khudn kho bai bao nay, ngudi ta da dvta ra mdt phuang phap HPLC nhay vdi viec xfl ly miu huyet tuong don gian de phan tfch vdt cua tobramycin trong huyet tuong ngudi. Cac tac gia da dung

f-naphthyl isothiocyanat (NITC) lam tac nhan tao din chat va dung methylamin de loai bo NITC du sau qui trinh din xuat hda. Phuong phap dugc de xu^t nay cd thd ap dung dugc dd'i vdi cac khang sinh aminoglycosid khac trong viec nghien cuu kiem soat thudc trong lam sang.

2. Thuc nghiem

2.1. Hoa chdt, thudc thd:

Tobramycin, 1-naphthyl isothiocyanat (NITC), anthracen (chuan ndi, LS), methylamin, pyridin,

28 Tap chi KlfiM NGHlfiM THU6C - Sd 1.2010; Tap 8.(27)

(2)

acetonitril va mdt sd thudc thfl khIc. Miu huyet tuong trlng tfl ngudi khde manh. Cac dung dich tobramycui cd ndng do khIc nhau dugc chuin bi bang cIch hda tan mdt lugng thfch hgp tobramycin trong nudc khfl ion. Thudc thfl tao din chat, NITC, mdi pha trong pyridin vdi ndng do 80mM. Pha dung dich methylamin 0,48M trong acetonitril.

2.2. Dieu kien sac ky:

May sic ky long Waters 717 cd he thd'ng dem miu tu ddng, detector quang phd UV-VIS model 486, he thd'ng bom dung mdi modul 126 - Beckman va phan mem xu ly sd lieu Gold.

Cdt phan tich: Purospher STAR RP-f8e (55 x 4mm; 3pm, Merck).

Pha ddng: Nudc - acetonitril (50 : 50). Lgc va loai khf.

Detector: Dat d budc sdng 230nm.

Tdc do ddng: 1,3 ml/phut.

The tich tidm: lOpl.

2.3. Chudn bi mdu vd tao ddn chdt:

Hut 0,4ml huyet tuong ngudi vao cac dng nghiem thuy tinh cd nut, dung tich 10ml. Thdm vao mdi dng 0,1ml dung dich trong nudc cd ehfla tobramycin vdi cac ndng do khac nhau de chuan bi cac miu tobramycin trong huyet tuong cd ndng do cudi cung tfl 0,93 de'n 9,34mg/l. Cac dng dugc lie deu trong 10 giay. Them 0,5ml acetonitril vao cac dng va lie xoly trong 1 phflt. Ly tam cac dng d lOOOg trong 10 phut.

Hut 0,8ml Idp dung dich phia trdn, chuyen vao mdt dng nghiem thuy tinh cd nut dung tich lOml. Sau dd them tie'p 0,3ml dung dich NITC 80mM trong pyridin va 0,1ml dung dich anthracen 250pM trong acetoiutril. Hdn hgp phan ung dugc lie trong 1 gid d nhiet do 70°C trong mdt be nudc dieu nhiet. Sau phan ung, them 0,1ml dung dich methylamin 0,48M trong acetonitril, hdn hgp phan ung dugc lie trong 5 phut d 70°C d^ loai bd phin thudc thfl du, ly tam d lOOOg trong 5 phflt. Tidm 10 pi Idp dung dich phfa tren vao he thd'ng HPLC de phan tfch.

2.4. Ddnh gid dp chinh xac vd dp diing:

Dd tin cay va do tai lap cua phuong phap da dua ra dugc xac dinh bing cIch chiet tobramycin tfl huyet tuong, vdi 5 ndng do khac nhau cua tobramycin (0,93; 2,33; 4,65; 6,98 va 9,34mgA), sau dd tao din chai theo qui trinh da md ta b trdn. Kha nang thu hdi tuong ddi tobramycui tfl huyet tuong dugc tien hinh tren 3 ndng dd khIc nhau cua tobramycin (1,86; 5,58 va 8,37mg/l) va dugc xfl ly theo nhu md ta d muc 2.3.

3. Ket qua va ban luan 3.1. Su tao ddn chdt hoa hpc:

Ca'u tnic cua tobramycin dugc chi ra tren hinh 1.

Ngoai cac nhdm ehflc ra, phan tfl tobramycin thieu cac nhdm mang mau cd kha nang cho tin hieu rd rang va dn dinh d vung UV. Chfnh vi didu nay, viec phan tich tobramycin true tie'p bing HPLC vdi detector UV la khdng d i lam. Tao din chat hda hge cd the lam thay ddi cac chat de tao ra hieu qua hap thu d vung tfl ngoai hoac kha kie'n. Do dd, vdi detetctor UV-VIS phuong phap tao din chai hda hge dugc lua chgn cho viec phan tfch tobramycin trong huyet tuong. Cac nhdm amin bac nhat cua tobramycin phan ung vdi NITC (dugc them vao) de tao din chat naphthyl isothioure. Ngudi ta thudng cho ring phan flng kdt hgp gifla tobramycin va NITC dugc dien ra nhu minh hga dhinh I.

3.2. Anh hudng eda luang thudc thd:

De thie't ke dugc lugng thudc thfl tao din chat (NITC) tdi uu vdi tobramycin trong huyet tuong, ngudi ta cho cic lugng NITC khac nhau trong khoang tu 3 de'n 30pmol (0,3ml cua cac dung dich 10- lOOmM) trong pyridin phan ung vdi tobramycin ndng do 9,34 mgA d 70°C trong 1 gid. Cac thdng sd dugc xac dinh bing cIch xfl ly trdn may tfnh cac gia tri ty so giua dien tich pic cua din chit tobramycin thu dugc va chuin ndi anthracen. Lugng NITC dung de tao din chat dugc the hien trong hinh 2. Mdt lugng du NITC (24pmol; 0,3ml; 80mM) dugc sfl dung de bd sung cho lugng tieu thu thudc thfl tao din chat cd the cd do nudc hoac su cd mat cua cac thanh phan khac trong huyet tuong ngudi. Do lugng thudc thfl tao din chat du dugc them vao de lam tang tdc do phan flng, mdt pic ldn cua NITC cung dugc tim thiy trong nghien cuu nay. Cac tac gia da dung methylamin de loai lugng thudc thfl du sau khi din xuit hda.

6 12 18 24 30 36 1-naphlhyl isothiocyanal (ijmol)

Hinh 2. Anh huong cua lupng NTTC len su tgo thdnh ddn chdt cUa tobramycin.

Tap chi KlfiM NGHlfiM THUOC - So 1.2010; Tap 8.(27) 29

(3)

Cac phan ung dugc thuc hien d 70°C trong 1 gid vdi 0,3ml dung dich NITC 10-lOOmM trong pyridin ddng vai trd la thudc thfl tao din chat.

3.3. Anh hudng cua nhiet dp vd thdi gian phdn dng:

Tobramycin cd nhidu nhdm ehflc cd the phan ung vdi NITC, chinh vi vay se tao ra nhiiu san phim cdng hgp khIc nhau dudi cac dieu kien nhiet dd va thdi gian phan ung khac nhau, ket qua thu dugc la mdt sic ky dd phflc tap. anh hudng cua thdi gian phan flng tai nhiet dp 50°C va 70°C len qua trinh tao dSn chat cua tobramycin trong huyet tuong d ndng do 9,3mgA dugc the hien tren hinh 3. Nd'u din xuat hda b 70°C, su tao thanh din chat cua tobramycin dat dugc can bing sau 0,5 gid, trong khi dd phan ung d 50°C dat dugc can bang sau 1 gid vdi lugng d i n chat tobramycin duoc tao thinh thap hon so vdi phan ung d70°C.

- /"""H

/y

I 1

_ _ - _ — — •

- • - 5 0 " C -<-70"C

30 60 90 Thdi gian (min)

120 150

Hinh 3. Anh huong cua nhiet dp vd thoi gian phdn ting lin sutao thdnh ddn chdt cua tobramycin. Cdc phdn ting dupc thuc hiin d 50°C vd 70°C trong cdc thdi gian

khde nhau vdi 0,3ml dung dich NTTC 80mM trong pyridin dong vai trd la thudc thti tao ddn chd't

3.4. Dp chpn loc cUa phuang phdp:

Sic ky dd dien hinh cua viec phan tfch tobramycin chiet ra tfl huyet tuong dugc the hien trdn hinh 4B. Pic 1 va 2 lan lugt la pic cua din chat tobramycin va chuan ndi. Pic ldn va pic nhd hon, dugc ve bing net gaeh rdi, ti-ong hinh 4B lan lucrt la pic cua NITC va tap cha't cua thudc thfl. Cac chat nay cd the phan ung dugc vdi methylamin. Do dd, 48pmol methylamin se dugc cho them vao cudi qui trinh din xua't hda de loai bd lugng NITC du va tap chat cua nd. Khdng cd tin hieu nhiiu nao rtf miu trlng 11 thudc thfl anh hudng de'n pic din cha't cua tobramycin (hinh 4A). Nghidn cun do chgn lgc cua phuang phap bing each chuan bi cac miu dung dich tobramycin chuan vdi su cd mat cua cac khang sinh aminoglycosid khac bao gdm kanamycm A, kanamycin B, gentamycm va amikacm. Cac mau

huyet tuong nay dugc phan tfch theo qui trinh md ta d tren (muc 2.3). Din chat naphthyl-tobramycin da dugc tach ra khdi din chat eua cac hoat cha't khac. "Dieu do chung td ring vide phan tfch tobramycin bing HPLC trong nghien cun nay khdng bi cac khing sinh aminoglycosid khac gay can trd. Khi thay ddi thanh phin pha ddng tfl ty Id nudc-acetonitril (50:50) vdi tdc do ddng l,3ml/phflt sang ty le nudc-acetonitril (57:43) vdi tdc dp ddng 0,8ml/phut thi ca 4 khang sinh aminoglycosid dugc tach ra rieng biet trdn sic ky do.

Thfl tu rfla giai la amikacin, kanamycin A, kanamycin B va tobramycin. Khdng phat hidn thay gentamycin trong dieu kien thfl nghiem nay. So sinh thdi gian luu cua din cha't tobramycin va din chat amikacin trong diiu kien sic ky da neu, dua ra gia thuyet la san phim cdng hgp naphthyl-tobramycin so nudc hon san phim cdng hgp naphthyl-amikacin. Tobramycin va amikacin lan lugt cd 5 va 4 nhdm amin bac nha't cd the phan ung vdi NITC. Cac khang sinh cephalosporin thudng dugc phdi hgp vdi cac khIng sinh aminoglycosid, vi du nhu tobramycin, trong dieu tri cac nhiim trung nang. De nghien cihi anh hudng ciia su gay nhiiu, cac dung dich chuan cefamandol va cefotaxim (200mg/l) dugc thdm vao cac miu huyet tuong cd ehfla tobramycui ndng dd 9,34mg/l. Tren sic ky dd thu dugc, khdng phat hien them bat ky pic nao khac. Diiu nay cho thay, phuong phap da de xuit la dac hieu va kha thi de phan tich tobramycin trong huyet tuong, giup cho viec kiem soat thudc dieu tri.

Hinh 4. Cdc sac ky do dinh luong tobramycin trong huyit tuong ngudi. (A): mdu huyi't tucng trang.

(B): tobramycin trong huyi't tuong ngudi co them methylamin (dudng lien) vd khong thim methylamin (dudng gqch rdi) sau khi tao ddn chd't. Pic I: ddn chdt

tobramycin: pic 2: anthracen. Dieu kiin sac ky theo muc 2.2.

30 Tap chi K I £ M NGHlfiM T H U 6 c - Sd 1.2010; Tap 8.(27)

(4)

3.5. Su chudn hoa phdn tich:

De nghien curu khoang ndng do ap dung trong phuang phap da dua ra, ngudi ta danh gii trdn 5 ndng do tobramycin khac nhau trong khoang tfl 0,93 den 9,34mgA. Phuong trinh hdi qui tuyen tfnh dat dugc nhu sau: cho dinh lugng trong ngay (n=6, r=0,999) va cho dinh lucmg giua cac ngay (n=6, r=0,998); y la ty sd giua dien tfch cua pic din chat vdi chuan ndi, x la ndng do tobramycin (mgA) va r 11 he sd tuong quan. Cac sd lieu cho thay phuong phap cd do tuyen tfnh td't. Do chfnh xac (do lech chuan tuong ddi, RSD) cua do ddc cic dudng chuan trong ngay va cac dudng chuin cua cac ngay phan tich khac nhau lln lugt la 1,0 va 2,6%. Gidi han phat hien (ty sd gifla tin hieu va nhiiu = 3) cua tobramycin la 0,23mgA vdi the tfch tiem fOpl. Do dn dinh cua tobramycin trong huyet tuong trong qui trinh bao quan cung dugc nghien cflu. Nghien cfln tobramycin trong huyet tuong d ndng do 9,34mg/l de danh gia do dn dinh cua

tobramycin bao quan b 0±2°C. Tien hanh xac dinh ndng do tobramycin trong huyet tuong vao cac ngay thfl nha't, 3, 5, 10 va ngay thfl 15. Phan tfch thd'ng kd cic ket qua thu dugc, khdng thay cd su khac nhau cd y nghia; do dd, tobramycin dn dinh trong miu huyet tuong bao quan d 0±2°C trong khoang 15 ngay.

3.6. Dp chinh xac vd dp ddng:

Do tai lap va do tin cay cua phuang phip dugc danh gii tren 5 ndng do khac nhau cua tobramycin va lan lugt dua vao RSD va kha nang thu hdi tuong dd'i.

Nhu da chi ra trong bang 1, do chfnh xac cua phuang phap dinh lugng tobramycin trong huyet tuong diu cd RSD nhd hon 5,2% ddi vdi ca dinh lugng trong ngay va dinh lugng gifla cac ngay. Kha nang thu hdi tuong dd'i cua tobramycin, nhu da chi ra trong bang 2, deu ldn hon 99%. Cac ket qua thu dugc dua tren dudng chuin dugc xay dung tfl cac miu huyet tuong cd ehfla lugng tobramycin khac nhau trong khoang tfl 0,93 den 9,34mgA.

Bdng 1. Dp chinh xde vd dp ddng ciia phdn tich tobramycin trong huyi't tUOng ngudi.

Bdng 2. Khd ndng thu hoi tuong ddi cua tobramycin trong huyi't tuong ngUdi.

Ndng do dd biet (mg/l)

Nong dp tim thdy (mg/l)

RSD

(%)

Sai so tuong doi

(%)

Trong ngay (n=6) (Kei qud thu duac tif 6 phdn tich lap lai)

0,93 2,33 4,65 6,98 9,34

0,96 ± 0,02 2,40 ± 0,04 4,59 ± 0,09 6,71 ± 0 , 1 4 9,52 ± 0,06

2,1 1,7 2,0 2,1 0,6

3,0 3,0 -1,3 -4,1 1,9 Giua cac ngay (n=6)

(Ke't qua thu duoc trong 6 ngay lien tie'p) 0,93

2,33 4,65 6,98 9,34

0,97 ± 0,05 2,34 ± 0,04 4,62 ± 0,08 6,83 ± 0,17 9,47 ± 0 , 1 0

5,2 1,7 1,7 2,5 1,0

5,0 0,6 -0,6 -2,2 1,4

MSu

1

2

3

Luang dua vao (mg/l)

1,86 5,58 8,37 1,86 5,58 8,37 1,86 5,58 8,37

Luang tim thay (*) (mg/l) 1,92 ± 0 , 0 4 5,72 ± 0,05 8,34 ± 0,06 1,94 ± 0 , 0 4 5,57 ± 0,07 8,46 ± 0,08 1,85 ± 0 , 0 2 5,83 ± 0,09 8,74 ± 0 , 1 2

Kha nang thu hoi tuang d6i(%)

103,2 102,5 99,6 104,3

99,9 101,2

99,5 104,5 104,4

*.• Gid tri trung binh ± SD cua 3 ldn phdn tich lap lai.

4. Ke't luan

Mdt phuong phap HPLC don gian, nhay, dua trdn su din xua't hda trudc cdt cua tobramycin trong huyet tuong ngudi vdi thudc thfl tao din cha't, NITC, da dugc xay dung va tdi iru hda. Viec thim dinh phuong phip dung trong dinh lucmg tobramycm cho thiy phuong phap cd dp chinh xlc cao. Phuong phip cd the ap dung de phan tfch tobramycin trong nghien ciiu kiem solt thudc trong lam sang.

Tap chi KlfiM NGHlfiM THUOC - Sd 1.2010; Tap 8.(27) 31

(5)

MUC LUC

Trang

• Qudn ly - Trao ddi nghiep vu

- Dinh hudng nhiem vu cdng tac k i e m tra va g i i m sat chat lugng thudc n a m 2 0 1 0 .

PGS. TS. TRINH VAN LAU - VIEN TRlfdNG VIEN Kim NGHIEM THUOC TW 1

• Nghien citu khoa hoc

- x a y dung va tham dinh phuong p h i p H P L C dinh lugng Nuciferin trong n g u y e n lieu.

NGUYEN THI KIM THANH, TRINH VAN LAU, GIAN THI LAN. HOANG THI TUYET NHUNG 4 - N g h i e n cfln dinh lugng Andrographolid trong vien n a n g antires b i n g H P L C .

HOANG VIET DUNG, NGUYEN MINH CHINH, TRAN VIET HUNG 8 - Nghien cfln xac dinh tap chat lien q u a n va dinh lugng Nevirapin b i n g p h u o n g p h a p H P L C dflng cdt

pha dao C18.

PHAM THI DUYEN, NGUYEN THI KIM THANH 11 - Dinh lugng 1- Deoxynojirimycin trong cao la dau va trong vien n a n g M o m s s a n b i n g s i c ky long khdi

phd.

NGUYiN THI HOA, LE THI PHUONG CHI, TRAN VIET HUNG, DAO THI THANH NHAN, NGUYEN QUOC BINH 19 - Nghidn cfln chiet xuat, phan lap, tinh che va n h a n d a n g Myricetin tfl la Che day dd thidt lap c h i t chuan

phuc vu k i e m n g h i e m dugc lieu.

m A ' VIET HtJNG, TRINH VAN LAU, PHAM THANH KY, VU HUONG THUY 22

• Thong tin khoa hoc-Tin tdc

- Phan tfch vet cua Tobramycin trong huyet tuong ngudi b i n g s i c ky long hieu n a n g cao, tao d i n chit va sfl dung Detector tfl ngoai.

Ngucd luge dich: TRAN THIJY HANH 28