TINJAUAN PUSTAKA
S- Adenosil-L Metionin (SAM) Sebagai Donor Metil
Fenomena metilasi DNA yang terjadi pada tanaman berperan untuk regulasi ekspresi gen yang berhubungan dengan differensiasi dan perkembangan. Metilasi sitosin pada genom eukariot penting untuk mengontrol ekspresi gen dan stabilisasi genom (Martienssen & Colot 2001 ; Bird 2002). Metilasi DNA berperan untuk mempertahankan kestabilan genom melalui kestabilan kromatin. Perubahan metilasi DNA genom ditentukan oleh keberadaan S-adenosil-L-metionin (SAM) karena SAM merupakan satu donor metil universal untuk sejumlah besar reaksi transfer metil. Metilasi sitosin pada DNA dikatalisis oleh ensim DNA metiltransferase yang mentransfer kelompok metil dari S-adenosyl-L-methionine (SAM) ke posisi 5 dari basa sitosin (C).
Meningkatnya konsentrasi SAM menstimulasi reaksi DNA metiltransferase untuk hipermetilasi dan melindungi genom terhadap hipometilasi (Detich et al. 2003). Sebaliknya suplai SAM yang tidak cukup berperan dalam
defisiensi donor metil penyebab hipometilasi Kekacauan metilasi sitosin pada mutan atau karena perlakuan inhibitor berperan terhadap kerusakan perkembangan pada organisme mulai dari tanaman, fungi sampai mamalia (Li et al. 1992; Okano et al. 1999 ; Martienssen & Colot 2001). Pada manusia, defisiensi donor metil (SAM) berkorelasi dengan meningkatnya resiko untuk tumor pada hati dan usus besar (Giovannucci et al. 1993). Defisiensi donor metil pada hewan lebih rentan untuk sejumlah tumor dan menunjukkan gejala lain yang tidak langsung berhubungan dengan metilasi DNA (Rogers 1995).
Ensim metiltransferase bertanggung jawab pada metilasi DNA genom tanaman, khusus pada Arabidopsis ada paling sedikit 10 gen yang mengkode metiltransferase, yang dapat dibagi kedalam tiga famili (Finnegan & Kovac 2000). Kelas pertama adalah metiltransferase 1 (MET1), famili kedua adalah chromomethylase (CMT) dan ketiga adalah domain rearranged methyltransferase (DRM) (Wada 2005). MET1 mempertahankan metilasi genom global dan mutan met1 memperlihatkan penurunan metilasi DNA secara drastis dan abnormalitas morfologi (Finnegan et al. 1996; Ronemus et al. 1996 ; Kankel et al. 2003). CMT mengontrol metilasi non-CpG (Cao & Jacobsen 2002a). Sedangkan ditemukan pada Arabidopsis, gen DRM1 dan DRM2 bertanggung jawab untuk metilasi sitosin pada transgene inverted-repeat pada situs CpNpG dan CpNpN (Cao & Jacobsen 2002b).
Menurut Radchuk et al. (2005) terdapat empat ensim yang bertanggung jawab untuk reaksi siklus metilasi yaitu metionin sintase, AdoMet sintase, methyltransferase yang tergantung SAM, S-Adenosil-L-Homosistein (SAH) hidrolase. Pada tanaman, AdoMet sintase dengan adanya ATP merubah hampir 80% metionin menjadi SAM. SAM digunakan untuk menghasilkan kelompok metil dan ditransfer melalui adanya metiltransferase namun dapat juga dikonversi menjadi AdoHcy (Radchuk et al. 2005). SAM dan SAH merupakan pertimbangan krusial untuk reaksi transfer metil dalam sel (Kocsis et al. 2003). Rasio SAM: SAH (ratio metilasi) menentukan aktifitas ensim metiltransferase (Cantoni et al. 1977). Menurunnya rasio SAM : SAH sebagai prediksi menurunnya metilasi yang berarti terjadi peningkatan SAH (Caudill et al. 2001).
Gambar 7. Jalur penggunaan S-Adenosil-L-Metionin (SAM atau AdoMet) dan pengaruh etilen. ACC ((1-aminosiklopropan-1
- asam karboksilat. carboxylic). MACC (malonil-ACC) (van der Straeten & van Motagu 1990).
Gambar 7. Jalur penggunaan S-Adenosil-L-Metionin (SAM atau
AdoMet) dan pengaruh etilen pada tanaman. ACC (1-aminosiklopropan-1 - asam karboksilat.). MACC
(malonil-ACC) (van der Straeten & van Montagu 1990).
Sebagian besar SAM (90%) disiapkan sebagai donor kelompok metil untuk sebagian besar transmetilasi DNA (Ravanel et al. 1998). Menurut Zingg dan Jones (1997) aberasi metabolisme SAM tidak hanya mempengaruhi metilasi DNA karena sebagai donor metil, tetapi juga sebagai donor aminopropil yang ditambahkan ke putresin membentuk poliamin spermidin dan spermin (Chiang et al. 1996). Kira-kira 1% SAM disiapkan untuk sintesis spermidin dan spermin melalui reaksi SAM dekarboksilase (Chiang et al. 1996), sisa SAM dirubah menjadi etilen (Gambar 7). Menurut Ravanel et al. (1998) SAM merupakan suatu intermediet untuk biosintesis fitohormon poliamin dan etilen.
Secara umum poliamin berperan dalam pertumbuhan dan perkembangan pada sebagian besar organisme (Tabor & Tabor 1984), melalui interaksinya dengan berbagai makromolekul dan membran. Spermin dan spermidin terlibat dalam berbagai respons stress pada tanaman, khususnya pertahanan terhadap kekeringan seperti yang diperlihatkan melalui over ekspresi AdoMetDC pada padi (Capell et al. 2004). SAM dikonversi menjadi ACC (1-aminosiklopropan-1-asam
karboksilat) oleh ensim ACC sintase (ACS), selanjutnya ACC dikonversi menjadi etilen oleh ensim ACC oksidase (ACO) (Yang & Hoffman 1984 ; Kende 1993). Berdasarkan hasil penelitian pada embriogenesis somatik pada wortel maka Minocha et al. (1990) menyimpulkan bahwa (1) auksin menekan embriogenesis, (2) auksin memacu biosintesis etilen, (3) etilen menghambat embrogenesis somatik, (4) penghambatan biosintesis poliamin mengakibatkan penghambatan embriogenesis, (5) biosintesis poliamin dipacu dengan memanfaatkan SAM dan menekan sintesis etilen karena menggunakan prekursor yang sama (SAM).
Metilasi DNA dan Penghambatan Ekspresi Gen
Modifikasi DNA telah dipostulasikan berperan sentral dalam regulasi epigenetik melalui pengaturan akses informasi genetik (Riggs 1975). Ditinjau dari genetik molekuler, epigenetik didefenisi secara sempit sebagai modifikasi heritable pada ekspresi gen tanpa perubahan pada sekuens nukleotidanya, dimana modifikasi ditandai dengan pola metilasi DNA dan atau modifikasi histon yang berhubungan dengan gen (Bender 2002). Metilasi adalah penambahan kelompok metil ke nukleotida DNA dan asam amino pada protein. Menurut Kalisz dan Purugganan (2004) bahwa dua tipe utama metilasi yang dihubungkan dengan perubahan epigenetik adalah metilasi DNA dan metilasi Histon.
Semua nukleotida DNA dapat termetilasi namun lebih umum bentuk metilasi DNA adalah metilasi pada basa sitosin (Martienssen & Colot 2001). Metilasi DNA terjadi pada tempat spesifik seperti yang dikatakan oleh Bird (1995) bahwa genom eukariot tidak termetilasi seragam tetapi hanya daerah spesifik yang sedangkan domain lain yang tersisa tidak termetilasi. Sebagian besar kelompok metil ditemukan pada CG. DNA eukariot tingkat tinggi, termetilasi pada atom karbon nomor 5 dari beberapa sitosin. Proporsi sitosin yang termodifikasi dengan metilsitosin (m5C) antara 3-8% pada vertebrata (Shapiro 1976), dan lebih dari 30% pada beberapa spesies tanaman (Shapiro 1976 ; Wagner & Capesius 1981 ; Matassi et al. 1992). Pada genom vertebrata, m5C lebih banyak pada dinukleotida CG sedangkan pada tanaman tingkat tinggi 5mC ditemukan pada beberapa sekuens genom nuklear terutama pada dinukleotida CG dan trinukleotida CNG. Metilasi sitosin pada nukelotida CG dan CNG ditemukan dalam frekuensi sepanjang kromosom dan bertindak untuk meregulasi ekspresi gen pada level gen
atau secara regional yang mempengaruhi daerah kromosom. Fungsi metilasi regional untuk menginaktif heterokromatin dan elemen pada atau yang dekat heterokromatin karena frekuensi metilasi pada daerah heterokromatin lebih besar dibandingkan dengan daerah eukromatin (Bird 1986), dan menurut Richards dan Elgin (2002) struktur heterokromatin memperlambat transkripsi sedangkan eukromatin mengaktivasi ekspresi gen.
Berdasarkan derajat kekompakkan dan aktivitas transkripsi maka kromatin dapat dibagi atas eukromatin yang aktif (aktivasi transkripsi) dan heterokromatin menghambat transkripsi. Asetilasi dan metilasi pada ujung N-terminal lisin (K) dari histon H3 dan H4 berperan penting dalam pembentukan heterokromatin pada berbagai organisme secara luas (Richards & Elgin 2002). Pada mamalia dan tanaman, akumulasi histon H3 yang termetilasi pada lisin 9 (H3K9Me) dan hipermetilasi DNA berhubungan dengan heterokromatin, sebaliknya hipometilasi dan adanya H3K4Me dipertimbangkan sebagai karakteristik eukromatin (Richards & Elgin 2002 ; Jenuwein & Allis 2001). Modifikasi histon tersebut dapat merubah struktur kromatin dan menghasilkan suatu range konsekuensi epigenetik spesifik yang merubah fenotip.
Fungsi metilasi sitosin pada sel eukariot kurang jelas. Namun banyak percobaan membuktikan adanya peranan metilasi DNA dalam mengatur ekspresi gen. Menurut Gardner et al. (1991) argumen-argumen untuk keterlibatan metilasi dalam kontrol ekspresi gen pada eukariot didasarkan terutama pada tiga macam bukti yang tidak langsung yaitu (1) sejumlah studi menunjukkan ada korelasi antara level ekspresi gen dan derajat metilasi yaitu metilasi rendah maka ekspresi gen tinggi, metilasi tinggi maka ekspresi gen rendah, (2) adanya pola metilasi jaringan spesifik pada beberapa kasus, dan (3) 5-azasitidin (basa analog dari sitosin) tidak dapat termetilasi setelah jenis obat ini bergabung dengan DNA sehingga gen dapat terekspresi pada jaringan yang secara normal tidak terekspresi. Muncul beberapa pendapat bahwa regulasi ekspresi gen oleh perubahan struktur kromatin lokal (Davey et al. 1997), pencegahan terikatnya protein binding DNA ke daerah promotor (Inamdar et al. 1991) atau sebagai suatu isyarat pengikatan represor transkripsi (Kass et al. 1997). Metilasi dan demetilasi sitosin pada daerah promotor merupakan mekanisme penting mengregulasi ekspresi gen
a
e
d
c
b
a
Gambar 8. Metilasi DNA pada promotor penyebab tidak aktifnya gen. (a) dan (b) faktor transkripsi dan protein regulator pada promotor berperan untuk aktif dan tidak aktifnya gen, (c) Metilasi pada 5mC, (d) dan (e) pengikatan represor pada 5mC terjadi remodeling kromatin dan deasitilasi histon penyebab gen tidak aktif secara lengkap (Alberts et al. 2002)
pada sel dan jaringan spesifik (Boyes & Bird 1991 ; Renckens et al. 1992). Menurut Lewin (1997) bahwa CG island mengandung konsentrasi doublet CG yang sering berada disekitar promotor dari gen-gen yang terekspresi konstitutif dan pada promotor dari gen yang akan diregulasi. Metilasi CG island pada suatu promotor biasanya menekan ekspresi gen. Penekanan disebabkan oleh salah satu dari dua protein (MeCP-1 dan MeCP-2) terikat dengan sekuens CG yang termetilasi. Protein MeCP-1 membutuhkan beberapa kelompok metil pada sekuens CG untuk terikat ke DNA sedangkan MeCP-2 membutuhkan hanya pasangan basa tunggal.
MeCP2 apabila terikat ke domain binding CG yang termetilasi menyebabkan terikatnya ko-represor (mSin3A) diikuti dengan deasetilasi histon (HDAC1 dan HDAC2). Seperti dikemukakan oleh Razin (1998) bahwa CG termetilasi menginduksi deasetilasi, remodeling kromatin, dan gen silensing melalui suatu kompleks represor transkripsi yang melibatkan deasetilasi histon (HDAC1 dan HDAC2) dengan mengelilingi mSin3A.
Asetilasi histon memacu trankripsi sedangkan deacetilasi menghambat transkripsi. Kelompok asam amino lisin histon bermuatan positif berinteraksi dengan DNA yang bermuatan negatif. Asetilasi lisin dapat menetralisasi muatan positif tersebut sehingga struktur kromatin kurang padat/kompak yang memberi ruang untuk terikatnya faktor transkripsi ke DNA. Sebaliknya apabila terjadi deasetilasi (penghilangan kelompok asetil) dapat menyebabkan kromatin lebih kompak dan terjadi silensing trasnkripsi.
Beberapa hasil penelitian menunjukkan metilasi menghambat transkripsi secara langsung melalui pencegahan pengikatan faktor transkripsi spesifik, atau secara tidak langsung melalui pembentukan represor kompleks melalui protein binding pada CG yang termetilasi (Gambar 8). Dikemukakan juga oleh Finnegan (2001) bahwa protein yang terikat pada 5mC seperti MeCP2, berinteraksi dengan ko-represor kompleks sehingga terjadi deasetilasi (asetil terlepas) mengakibatkan transkripsi terhambat. Pengepakan DNA dalam nukleosom dan struktur lebih kompak merupakan suatu hambatan untuk mengregulasi protein binding DNA (Niu et al. 1996), dan RNA polimerase (Williamson & Felsenfeld 1978) untuk proses transkripsi.
Metilasi DNA dan Perkembangan Tanaman
Sebagian besar hipotesis mengatakan bahwa pola metilasi yang terbentuk selama perkembangan mengalami demetilasi pada jaringan spesifik dimana kelompok metil dilepaskan dari tempat kritis dari suatu gen yang telah dijadwalkan terekspresi pada tipe sel tertentu. Pada perkembangan awal sel embrio, sebagian besar gen termetilasi kemudian diferensiasi sel membentuk jaringan spesifik terjadi penghilangan kelompok metil pada basa sitosin (demetilasi) menyebabkan gen-gen terkespresi pada jaringan tersebut (Gardner et al. 1991).
Pada proses replikasi, situs CG atau CNG yang termetilasi akan berpasangan dengan utas baru yang tidak termetilasi yang dikenal sebagai situs hemimetilasi yaitu utas lama termetilasi dan utas baru tidak termetilasi. Pada proses selanjutnya situs hemimetilasi dikenal oleh ensim dan merubahnya menjadi lengkap termetilasi. Ketika suatu DNA yang termetilasi lengkap (full metilasi) diintroduksi ke dalam suatu sel maka secara kontinyu DNA tersebut termetilasi melalui sejumlah siklus replikasi. Jika DNA nonmetilasi diintroduksi maka tidak termetilasi secara de novo. Ini menunjukkan bahwa ensim hanya mengenal situs yang hemimetilasi untuk menghasilkan metilasi lengkap (Lewin 1997). Dikatakan bahwa metilasi sekuens simetrik ini (model semi-konservatif) memberikan signal untuk transmisi metilasi melalui aksi ensim maintenaice metiltransferase untuk menempatkan metil ke sitosin pada utas yang baru disintesis, jika utas komplemennya membawa 5mC (Holiday & Pugh 1975 ; Riggs 1975).
Ensim maintenance metilase bertindak memetilasi sekuens CG yang berpasangan basa dengan GC (orientasi berlawanan). Maintenance metilase menunjuk pada pewarisan automatik 5-metil nukleotida pada keadaan hemimetilasi, namun secara normal tidak dapat memetilasi DNA yang tidak termetilasi penuh (Alberts et al. 1994). Menurut Lewin (1997) kondisi metilasi dapat hilang dengan dua cara yaitu (1) gugus metil secara efektif dihilangkan oleh ensim demetilase, dan atau (2) gagal terjadi metilasi pada situs hemimetilasi dan diturunkan melalui replikasi selanjutnya. Penghilangan kelompok metil dari sekuens DNA diistilahkan sebagai demetilasi, sedangkan hipometilasi adalah berkurang metilasi pada sekuens DNA yang secara alami termetilasi.
Peran metilasi sitosin dalam perkembangan tanaman telah diperlihatkan melalui paling sedikit tiga macam pembuktian yang berbeda yaitu (1) ekspresi spesifik dari beberapa gen pada perkembangan benih, (2) kontrol waktu pembungaan dan morfogenesis bunga, (3) dan korelasi dengan silensing dari sekuens DNA (mobile elemen genetik dan transgen) (Zluvova et al. 2001). Mekanisme pada benih adalah tidak adanya transkripsi berkaitan dengan hipermetilasi DNA. Metilasi DNA dipelajari pada benih gandum selama perkecambahan yaitu terjadi reduksi kandungan 5mC yang diamati melalui penambahan aktivitas metabolik (Drozdenyuk et al. 1976). Zluvova et al. (2001)
menemukan bahwa metilasi relatif tinggi pada benih namun kemudian mengalami hipometilasi secara bertahap yaitu dimulai pada sel ekstraembrionik (endosperm), kemudian kontinyu pada hipokotil, dan akhirnya pada kotiledon.
Pembungaan tanaman mempunyai level metilasi sitosin lebih tinggi dan pada perkembangan lanjut pembungaan terjadi penurunan substansial derajat metilasi DNA. Menurut Zluvova et al. (2001) bahwa derajat metilasi tinggi ditemukan pada zone sentral dari meristem shoot apical selama periode pertumbuhan vegetatif dan pada daerah ini aktivitas pembelahan sel rendah. Namun pada waktu transisi meristem apikal ke kuncup bunga, terjadi penurunan status metilasi dan pembelahan sel dimulai. Dikatakan juga bahwa demetilasi DNA diamati terutama untuk replikasi DNA pada semua kasus. Pembelahan sel terjadi sesaat setelah replikasi DNA, kemudian utas DNA yang baru terbentuk mengalami remodeling kromatin untuk menjaga kestabilan kromatin tersebut.
Razin dan Cedar (1994) mengatakan bahwa metilasi sitosin (kecuali yeast) mempunyai peranan sangat penting dalam pengontrolan perkembangan pada hewan, dan terjadi gangguan pola metilasi sering berperan untuk perkembangan abnormal. Demikian juga Jacobsen dan Meyerowitz (1997) mengemukakan bahwa perubahan pada level metilasi yang menginduksi mutasi atau supresi gen metilase menyebabkan perubahan morfologi dan fisiologi secara nyata pada tanaman. Sejumlah aberasi perkembangan yang terjadi dihipotesiskan sebagai hasil dari hipometilasi genom global yang diinduksi secara genetik atau epigenetik dalam sekuens tunggal pada tanaman maupun hewan (Finnegan et al. 1996 ; Baylin & Herman 2000). Abnormalitas fenotipik disebabkan oleh akumulasi mutasi (Chen et al. 1988 ; Miura et al. 2001), mirip dengan perubahan epigenetik heritable pada metilasi DNA (Kakutani et al. 1996 ; Jacobsen et al. 2000 ; Soppe et al. 2000) yang berperan merubah ekspresi gen.
Pemisahan Nukleosida Dengan Teknik HPLC
Teknik kromatografi yang dapat digunakan untuk menganalisis komposisi basa utama dan basa minor dari total basa DNA meliputi gas-liquid chromatography, cation-exchange chromatography, reverse-phase HPLC, paired- ion reverse-phase HPLC dan gas chromatography-massspectrometry. Metode
mass spectral dan immunologikal juga dapat dipakai untuk analisis DNA. Prinsip pemisahan kolum khromatografi digambarkan melalui suatu kolum yang dipadatkan dengan suatu fase stasioner granular padat dengan tinggi 5 cm, dikelilingi dengan fase gerak yang berada 1 cm3 per cm dari kolum. Suatu senyawa ditambahkan ke kolum pada 1 cm3 fase gerak akan bergerak pada kolum untuk menempati posisi teratas. Senyawa tersebut ditambahkan lagi ke kolum pada 1 cm3 fase gerak sehingga memperlihatkan pergerakan fase gerak, dan posisi teratas bergerak ke posisi dibawahnya (Wilson & Walker 2000).
Tipe sistim kolum kromatografi menggunakan fase gerak cair terdiri atas kolum, suatu wadah fase gerak dengan sistim deliver, suatu pendeteksi (detector) untuk identifikasi senyawa (analytes) yang dipisahkan melalui eluent dari kolum, suatu pencatat (recorder) serta suatu fraksi kolektor. Pendeteksi dan pancatat (recorder) secara kontinyu mencatat adanya senyawa-senyawa pada eluent, diukur melalui parameter fisik seperti absorpsi ultraviolet. Kemudian masing-masing senyawa yang dipisahkan ditampilkan lagi melalui suatu puncak (peak) pada kertas pencatat (Wilson & Walker 2000).
Terdapat dua partisi kromatografi yang biasanya digunakan yaitu normal phase liquid chromathography dan reverse phase liquid chromatography (RP- HPLC). Perbedaan keduanya pada polaritas relatif dari fase gerak (mobile) dan diam (stasioner). Pada kromatografi fase normal cair, fase diam merupakan suatu senyawa polar seperti alkil nitril atau alkilamin, sedangkan fase gerak pelarutnya nonpolar seperti hexane. Untuk RP-HPLC, pelarut fase tetap adalah senyawa non polar seperti octasilan (OS) atau octadesilan (ODS), sedangkan fase gerak adalah pelarut polar seperti air/asetonitrile atau air/methanol (Wilson & Walker 2000).
Level metilasi yang terjadi pada DNA genomik dapat diukur dengan teknik pemisahan high-performance melalui ensimatik/kemikal. Untuk mengetahui konsentrasi metilsitosin dalam DNA genomik dikuantifikasi dengan high- performance separation seperti High Performance Liquid Chromathography (HPLC) dan High Performance Capillary Electrophoresis (HPCE) atau pendekatan ensimatik/kemikal (Fraga & Esteller 2002). Kuo et al. (1980) mengatakan bahwa metode RP-HPLC merupakan alat penelitian yang bermanfaat dalam studi berbagai subfraksi DNA dan membantu untuk menguraikan metilasi
DNA. Menurut Bellucci et al. (2002) metode untuk mendeteksi terjadinya metilasi secara biokimia yaitu Spektrofotometrik dan High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Kubis et al (2003) membuktikan bahwa RP-HPLC mampu mengidentifikasi tiap nukleotida termasuk metilsitosin dan sitosin dari DNA tanaman normal dan regeneran. Hasil analisis HPLC tersebut menunjukkan bahwa tingkat metilasi lebih rendah pada pohon-pohon yang barasal dari klon buah mantel dibandingkan dengan tanaman tetua. Perkiraan jumlah 5-metilsitosin genomik memperlihatkan adanya hipometilasi yang nyata pada kalus pertumbuhan cepat dan daun regeneran mantel dibandingkan dengan regeneran normalnya (Jaligot et al. 2000).
Identifikasi Variabilitas Genetik dengan Teknik RAPD
Tanaman-tanaman yang berasal dari kultur jaringan memperlihatkan keragaman somaklonal. Berbagai strategi dilakukan untuk mengevaluasi struktur genetik dari klonasal in vitro namun mempunyai keterbatasan. Strategi yang umum digunakan adalah melalui penanda morfologi karena mudah dilakukan, cepat dan relatif lebih mudah. Penanda morfologi ini mempunyai kelemahan karena karakter yang diamati kemungkinan dipengaruhi oleh lingkungan. Penanda sitologi tidak dapat memperlihatkan perubahan dalam gen tertentu atau dalam pengaturan kembali kromosom yang kecil (Isabel et al. 1993). Penanda molekuler didasari oleh adanya polimorfis pada tingkat protein atau DNA. Penanda molekuler protein (isoensim) merupakan metode yang sesuai untuk mendeteksi perubahan genetik namun terbatas dalam jumlah sampel, dan hanya daerah pengkode protein saja yang terdeteksi. Sedangkan penanda molekuler DNA untuk mendeteksi variabilitas genetik melalui variabilitas sekuens nukleotida meliputi teknik RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism, dan SSR (Simple Sequences Repeast / microsatelite (Powell et al. 1996), namun tiap teknik tersebut juga mempunyai keterbatasan.
RAPD merupakan suatu teknik untuk mengidentifikasi keragaman genetik (Welsh & McClelland 1990). Analisis RAPD dengan PCR menggunakan primer memperlihatkan sensitifitas dalam mendeteksi keragaman di antara individu
(de Enrech 2000). Keuntungan dari teknik ini adalah (1) dapat menggunakan sejumlah besar sampel dan relatif cepat, serta secara ekonomi menggunakan bahan dalam jumlah mikro, (2) amplikon tidak tergantung dari ekspresi ontogenetik, dan (3) banyak daerah genom dapat disampling dengan jumlah yang tak terbatas (Isabel et al. 1993). Namun teknik ini mempunyai keterbatasan yaitu tidak reproducible karena dipengaruhi oleh banyak faktor meliputi isolasi DNA (Korbin et al. 2000), konsentrasi DNA cetakan dan primer, konsentrasi Taq DNA polimerase, suhu penempelan primer pada cetakan (annealing), jumlah siklus thermal dan konsentrasi MgCl2 (Bassam et al. 1992 ; Kernodle et al. 1993).
Namun beberapa peneliti melaporkan bahwa mayoritas pita DNA reproducible jika digunakan protokol standar dalam tiap reaksi (Hedrick 1992 ; Gibbs et al. 1994), sehingga untuk mendapatkan hasil RAPD yang reproducible tinggi maka reaksinya perlu dioptimasi.
Prinsip kerja teknik RAPD berdasarkan mesin PCR (Polymerase Chain Raction) dapat mengamplifikasi sekuens DNA tertentu secara in vitro Menurut Williams et al. (1990) teknik RAPD yang didasarkan pada PCR menggunakan sekuens primer arbitrary pendek untuk menghasilkan amplifikon secara acak dari suatu genom. Polimorfis terdeteksi diantara hasil yang diamplifikasi sebagai hasil perubahan pada sekuens nukleotida spesifik pada satu atau kedua situs primer. Prinsip kerja PCR dengan memanfaatkan urutan nuklotida tertentu sebagai cetakan dan primer, seperti halnya pada proses replikasi DNA (Mullis & Faloona 1987). Satu siklus PCR terdiri atas tiga tahap yaitu tahap pemisahan utas ganda DNA genom (denaturasi), tahap penempelan primer (annealing) dan tahap pemanjangan atau sintesis DNA (extension). Tahap denaturasi, dua utas DNA genom dipisahkan secara sempurna, umumnya pada suhu 94-95oC. Tahap penempelan primer primer, primer menempel pada DNA cetakan dengan suhu bergantung pada komposisi, panjang dan konsentrasi primer, dan proses sintesis fragmen DNA namun sekitar 55oC Seperti yang dikemukakan oleh Pauls et al. (1993) bahwa suhu penempelan primer dipengaruhi oleh panjang primer dan persentase G/C dalam primer serta konsentrasi garam larutan penyangga. Tahap sintesis fragmen, terjadi polimerasi nukleotida yang dimulai dari ujung 3’ primer berdasarkan urutan DNA cetakan, suhu tahap ini bergantung pada panjang dan
susunan dari DNA cetakan, namun sekitar 72oC. Tiga tahapan diulang dalam beberapa siklus untuk mendapatkan kualitas fragmen yang nampak jelas.
Analisis RAPD merupakan suatu alat yang efisien untuk karakterisasi diverisitas genetik secara tepat di antara genotip kerabat dekat (Rajasegar et al. 1997). Marker RAPD dimanfaatkan khususnya untuk menguji stabilitas genetik diantara embrio somatik pada spesies Picea glauca (Isabel et al. 1993; 1996), dan diantara tanaman mikropropagasi dari Populus deltoides (Rani et al. 1995). Pola RAPD yang dihasilkan oleh primer mendapatkan persentase fragmen polimorfik yang tinggi di antara lima genotip kentang, mengindikasikan level tinggi keragaman genetik antara kultivar kentang (Bordallo et al. 2004). *ebrowska dan Tyrka (2003) menggunakan marker RAPD untuk identifikasi strawberry dan studi diversiti genetik, demikian juga Gaafar dan Saker (2006) dapat mengidentifikasi kultivar strawberry yang berbeda dan mendeteksi keragaman genetik tanaman strawberry hasil perbanyakan mikro. Dikatakan juga bahwa teknik RAPD efektif dengan memperlihatkan pola pita yang spesifik genotip sehingga dapat digunakan untuk identifikasi kultivar. Hasil penelitian Rout et al. (1998) menunjukkan bahwa analisis RAPD dapat dipakai untuk akses kebenaran genetik dari tanaman yang berasal in vitro dalam skala industri sebagai bagian program perbaikan tanaman. Hasil penelitian pada strawberry in vitro menunjukkan adanya variabilitas genetik melalui pola pita RAPD namun morfologi daunnya mempunyai keragaman minor (Gaafar & Sekar 2006).
BAB III
KARAKTERISASI MORFOLOGI BUNGA DAN