1.
Persiapan kultur Bacillus cereus
Persiapan kultur bakteri Bacillus cereus bertujuan untuk menjamin keseragaman bakteri saat pengujian aktivitas antibakteri. Uji konfirmasi dengan pewarnaan Gram pertama kali dilakukan untuk mengetahui apabila terjadi kontaminasi dalam kultur bakteri yang digunakan. Pada Gambar 16 terlihat bahwa bakteri yang diuji berbentuk batang dan merupakan bakteri Gram positif karena menunjukkan morfologi berwarna ungu. Hasil pewarnaan ini sesuai dengan ciri-ciri Bacillus cereus yang berbentuk batang dan merupakan Gram positif (Gibbs 2003).
Gambar 16. Hasil pewarnaan gram bakteri Bacillus cereus (a) hasil penelitian dan (b) referensi (Anonim2 2012)
Pada penelitian ini jumlah bakteri awal Bacillus cereus diketahui sebanyak 5.3x107 cfu/ml. Jumlah kultur yang digunakan dalam pengujian aktivitas antibakteri harus diseragamkan. Jumlah kultur bakteri yang direkomedasikan adalah ~105 cfu/ml. Apabila jumlah kultur yang ditambahkan > ~105 cfu/ml maka nilai MIC akan lebih besar (Wiegand et al. 2008) dan pada uji difusi sumur zona penghambatan tidak dapat terlihat akibat koloni bakteri yang terlalu banyak (Paris dan Davidson 1993). Oleh karena itu, dalam penelitian ini sebelum kultur Bacillus cereus diinokulasikan kultur tersebut terlebih dahulu diencerkan hingga 100 x untuk mendapatkan jumlah yang diinginkan.
2.
Uji difusi sumur
Pengujian aktivitas antibakteri dengan metode difusi sumur dilakukan dalam dua tahapan. Pada tahapan yang pertama pengujian dilakukan terhadap seluruh ekstrak hasil ekstraksi bertingkat, sedangkan untuk tahapan kedua pengujian dilakukan berdasarkan berat ekstrak kering dari ekstrak yang menunjukkan aktivitas antibakteri pada tahapan pertama. Tahapan kedua bertujuan mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak buah takokak berdasarkan berat ekstrak kering sehingga data yang dihasilkan dapat lebih baik.
Pengujian aktivitas antibakteri ekstrak buah takokak dilakukan menggunakan metode difusi sumur yang mengacu pada metode Shan et al. (2007) yang dimodifikasi. Metode difusi sumur merupakan metode pengujian aktivitas antibakteri in vitro yang bersifat kualitatif (Paris dan Davidson 1993). Hasil aktivitas antibakteri ditunjukkan dengan zona bening di sekitar sumur sehingga akan didapatkan nilai diameter penghambatan (diameter of inhibition zone (DIZ)) dari ekstrak yang diujikan. Nilai DIZ yang diperoleh pada penelitian ini merupakan selisih antara diameter lubang sumur dan zona bening yang terlihat di sekitar sumur. Pengukuran nilai DIZ ini dilakukan menggunakan jangka sorong sehingga diperoleh ketelitian data sebesar 0.1 mm.
Pada penelitian ini digunakan konsentrasi 200 mg/ml untuk masing-masing ekstrak dalam pengujian aktivitas antibakteri menggunakan metode difusi sumur. Nilai konsentrasi ini merupakan konsentrasi terendah yang digunakan pada penelitian Kannan et al. (2012) yang menunjukkan adanya aktivitas penghambatan. Hasil pengujian aktivitas antibakteri ekstrak buah takokak hasil ektraksi bertingkat dapat dilihat pada Gambar 17a. Pengujian metode difusi sumur dari seluruh ekstrak hasil ekstraksi bertingkat ini merupakan tahapan pendahuluan untuk mengetahui gambaran umum aktivitas antibakteri pada buah takokak.
Dari hasil pengujian metode difusi sumur ini terlihat bahwa hanya ekstrak F1 hingga F5 yang menunjukkan adanya aktivitas penghambatan dengan nilai DIZ mulai dari 0.5 hingga 6.6 mm. Ekstrak lainnya, yakni F6 hinggga F8 memiliki nilai DIZ 0 mm yang artinya tidak memiliki aktivitas penghambatan terhadap Bacillus cereus. Pengujian tahapan pertama ini menggunakan ekstrak langsung hasil ekstraksi bertingkat yang diduga masih mengandung residu pelarut. Oleh karena itu, dilakukan juga pengujian aktivitas antibakteri metode difusi sumur terhadap pelarut yang digunakan saat ekstraksi. Hasil pengujian aktivitas antibakteri terhadap pelarut menunjukkan bahwa baik pada pelarut metanol 100% hingga metanol : air (8 : 2) memiliki nilai DIZ 0 mm yang artinya tidak memiliki aktivitas antibakteri (Lampiran 7). Penelitian Dash et al. (2011) menunjukkan bahwa metanol sebagai kontrol negatif tidak membentuk zona penghambatan terhadap bakteri Pseudomonas spp., Shigella dysentriae, Salmonella typhii dan E. coli. Pelarut metanol juga tidak menunjukkan aktivitas penghambatan dengan nilai DIZ 0 mm pada bakteri Bacillus lainnya yaitu Bacillus subtilis (Lachumy et al. 2010). Selain pengujian terhadap pelarut,
dilakukan pula pengujian berdasarkan berat ekstrak kering sebagai koreksi terhadap hasil pengujian tahapan pertama akibat adanya residu pelarut yang tertinggal. Hasil pengujian tahapan pertama menunjukkan bahwa hanya ekstrak F1 hingga F5 yang berpotensi memiliki aktivitas sebagai antibakteri sehingga untuk tahapan kedua hanya ekstrak tersebut yang akan diujikan.
Pengukuran kadar air terhadap lima ekstrak yang terpilih dilakukan sebelum pengujian tahapan kedua. Pengukuran kadar air ekstrak ini menggunakan metode oven vakum (AOAC 925.45 1999) karena diduga ekstrak mengandung komponen gula yang cukup tinggi. Hasil pengukuran kadar air dapat dilihat pada Lampiran 8. Kadar air ekstrak buah takokak hasil ekstraksi bertingkat cukup bervariasi yakni antara 6.00% hingga 20.00%. Setelah data kadar air ekstrak F1 hingga F5 didapatkan maka pengujian aktivitas antibakteri ekstrak buah takokak berdasarkan berat ekstrak kering dapat dilakukan. Hasil pengujian tahapan kedua ini dapat dilihat pada Tabel 7.
Pada tahapan kedua ini digunakan kontrol negatif yaitu DMSO dan kontrol positif kloramfenikol. Hasil ekstraksi umumnya mengandung komponen yang tidak homogen sehingga diperlukan pelarut untuk mencampurkan seluruh komponen dalam ekstrak tersebut (Cannell 1998). Salah satu pelarut yang cukup banyak digunakan dalam pengujian aktivitas antibakteri adalah DMSO ( Chah et al. 2000; Naz et al. 2011; dan Patel dan Rao 2012). DMSO merupakan pelarut yang digunakan untuk melarutkan ekstrak dan kloramfenikol. Pengujian terhadap kontrol negatif bertujuan untuk mengetahui pengaruh pelarut organik (DMSO) terhadap aktivitas antibakteri ekstrak buah takokak. Hasil pengujian pada kontrol negatif menunjukkan bahwa baik DMSO maupun kombinasi pelarut F1 hingga F5 memiliki nilai DIZ sebesar 0 mm. Menurut Sagdic et al. (2005), suatu sampel dikategorikan sebagai antibakteri yang kuat apabila memiliki nilai DIZ > 20 mm, sedang bila nilai DIZ 16-20 mm, cukup bila nilai DIZ 10-15 mm, lemah bila nilai DIZ 6-9 mm dan tidak efektif sebagai antibakteri apabila nilai DIZ 0 mm atau tidak menunjukkan adanya zona bening di sekitar areal sumur. Oleh karena itu, kontrol negatif pada pengujian tahap kedua ini dikategorikan sebagai senyawa yang tidak efektif sebagai antibakteri sehingga
6.6 4.7 5.3 3.7 0.5 0.0 0.0 0.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 N il ai d iam e te r p e n gh am b at an * (m m ) Kode Ekstrak
Gambar 17a. Histogram hasil screening awal pengujian aktivitas antibakteri ekstrak buah takokak pada konsentrasi 200 mg berat basah ekstrak/ml
diduga tidak mempengaruhi hasil aktivitas antibakteri dari ekstrak buah takokak yang diujikan. DMSO juga diketahui tidak memberikan aktivitas penghambatan pada bakteri S. aureus dan E. coli (Bag et al. 2009; Walter et al. 2011) serta B. cereus (Karou1et al. 2005). Pada pengujian tahap kedua ini juga digunakan kloramfenikol sebagai kontrol positif. Konsentrasi kloramfenikol yang digunakan adalah 25 mg/ml DMSO. Pada Tabel 8 terlihat bahwa kontrol positif yaitu kloramfenikol menunjukkan nilai DIZ yang besar yakni 34.0±0.44 mm dan dapat dikategorikan sebagai aktivitas antibakteri yang kuat (Sagdic et al. 2005). Bila dibandingkan dengan nilai DIZ ekstrak buah takokak maka terlihat perbedaan yang cukup jauh. Ekstrak buah takokak memiliki nilai penghambatan tertinggi pada ekstrak F1 dengan nilai DIZ sebesar 7.1 mm pada konsentrasi 200 mg/ml sedangkan kloramfenikol pada konsentrasi 25 mg/ml atau 8 kali lebih kecil dibanding ekstrak buah takokak memiliki nilai DIZ yang jauh lebih besar.
Tabel 8. Hasil uji difusi sumur ekstrak terpilih berdasarkan berat kering ekstrak
*Konsentrasi ekstrak yang digunakan sebesar 200 mg berat kering ekstrak/ml
Kloramfenikol merupakan antibiotik sintetik yang diketahui dapat menghambat berbagai macam bakteri baik gram positif maupun gram negatif (Balbi 2004). Antibiotik ini juga diketahui efektif terhadap bakteri Bacillus cereus, oleh karena itu kloramfenikol digunakan sebagai kontrol positif (Drobniewski 1993). Kloramfenikol merupakan antibiotik yang bersifat bakteriostatik terhadap berbagai mikroba namun antibiotik ini juga dapat bersifat bakterisidal pada mikroba penyebab meningitis seperti H. influenzae, S. pneumoniae, and N. meningitidis. Sifat kloramfenikol sebagai bakteriostatik berhubungan dengan mekanisme penghambatannya terhadap bakteri. Secara umum, mekanisme kloramfenikol sebagai antibiotik adalah dengan menghambat sintesis protein. Kloramfenikol akan berikatan dengan ribosom sehingga menghambat aktivitas dari peptidyl transferase (Balbi 2004). Mekanisme penghambatan kloramfenikol ini juga berhubungan erat dengan pembentukan gugus hidroksil radikal oleh bakteri ketika berinteraksi dengan antibiotik (Kohanski et al. 2007). Penelitian saat ini menunjukkan bahwa telah banyak bakteri yang bersifat resisten terhadap antibiotik komersial, termasuk kloramfenikol. Selain resistensi bakteri, antibiotik sintetik juga memiliki efek negatif bagi kesehatan, oleh karena itu walaupun aktivitas penghambatan ekstrak buah takokak jauh lebih kecil dibanding kloramfenikol, buah takokak memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai antibiotik yang alami.
Ulangan Kode ekstrak*
Kloramfenikol (25 mg/ml) DMSO F1 F2 F3 F4 F5 (kontrol +) (kontrol -) 1 7.4 5.4 6.0 5.9 4.2 34.2 0.0 8.1 5.6 6.0 5.8 4.1 34.3 0.0 2 6.8 5.5 5.9 5.6 4.9 34.2 0.0 6.4 5.7 6.0 5.7 1.1 33.2 0.0 3 7.1 5.3 5.0 5.2 3.1 34.3 0.0 6.6 5.4 4.9 5.3 3.1 34.0 0.0 Rataan 7.1 ± 0.63 5.5 ± 0.15 5.6 ± 0.54 5.6 ± 0.26 3.4 ± 1.33 34.0 ± 0.44 0.0 ± 0.00
Pada Gambar 17b menunjukkan bahwa pengujian aktivitas antibakteri berdasarkan berat kering ekstrak pada ekstrak F1 hingga F5 menunjukkan peningkatan nilai diameter penghambatan dibanding pada pengujian tahap pertama. Pada tahap pertama nilai DIZ ekstrak F1 hingga F5 berkisar antara 0.5 mm hingga 6.6 mm namun pada pengujian tahap kedua berdasarkan berat ekstrak kering nilai DIZ menunjukkan peningkatan dengan kisaran 3.4 mm hingga 7.1 mm. Hal ini dapat membuktikan bahwa pada pengujian difusi sumur tahap pertama masih terdapat residu pelarut sehingga berat ekstrak sesungguhnya berkurang. Walaupun terjadi peningkatan nilai DIZ, ekstrak F1 tetap menghasilkan nilai diameter penghambatan yang terbesar dibanding keempat ekstrak lainnya dengan nilai 7.1 ± 0.63 mm.
Ekstrak F1 merupakan hasil ekstraksi pertama tepung buah takokak yang menggunakan pelarut metanol (100%). Metanol merupakan pelarut yang telah banyak digunakan dalam ekstraksi komponen aktif tanaman obat. Metanol termasuk ke dalam golongan alkohol seperti etanol, namun metanol lebih bersifat polar dibanding etanol. Pelarut alkohol ini lebih efisien dalam mengekstrak komponen polifenol dibanding air, hal ini diduga karena dalam air enzim polifenoloksidase akan aktif dan mendegradasi komponen polifenol yang telah terekstrak namun dalam pelarut alkohol, enzim ini tidak aktif (Tiwari et al. 2011).
Polaritas dari pelarut merupakan salah satu faktor penting dalam proses ekstraksi komponen metabolit. Hal ini didasarkan pada prinsip ekstraksi yaitu like dissolve like dimana pelarut polar akan mengekstrak komponen polar dan sebaliknya pelarut non polar akan mengekstrak komponen non polar (Visht dan Chaturvedi 2007). Komponen polifenol seperti flavonols merupakan komponen metabolit yang larut dalam pelarut polar (Cowan 1999). Kelarutan komponen fenolik dipengaruhi oleh keberadaan gugus polar dalam struktur kimianya (Hobson dan Davies 1971). Komponen fenol dan flavonoid diketahui telah dapat terekstrak oleh pelarut metanol (Moco et al. 2007). Metanol juga diketahui dapat mengekstrak komponen aktif antara lain antosianin, terpenoid, saponin, tannin,
*Nilai diameter penghambatan yang diperoleh merupakan hasil rataan dari tiga ulangan masing- masing duplo
Nilai rata-rata dengan huruf yang berbeda pada tiap batang menunjukkan analisis rata-rata nilai diameter penghambatan berbeda nyata antar sampel (nilai p<0.05)
Gambar 17b. Histogram hasil pengujian aktivitas antibakteri ekstrak buah takokak terpilih pada konsentrasi 200 mg berat kering ekstrak/ml
7.1 ± 0.63a 5.5 ± 0.15b 5.6 ± 0.54b 5.6 ± 0.26b 3.4 ± 1.33c 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 F1 F2 F3 F4 F5 N il ai d iam e te r p e n gh am b at an * (m m ) Kode Ekstrak
xanthoxyllin, totarol, quassinoid, lactone, flavon, phenon, dan polifenol (Cowan 1999). Dalam penelitian Arif dan Fareed (2011), ekstrak metanol dari buah takokak diketahui mengandung komponen alkaloid, gula pereduksi, saponin glikosida, flavonoid glikosida, tanin, fenol, dan protein.
Aktivitas antibakteri dari ekstrak buah takokak dipengaruhi oleh komponen- komponen aktif tersebut. Salah satunya adalah saponin, saponin yang dapat diekstrak dengan metanol menunjukkan efek sebagai antimikroba (Ncube et al. 2008). Saponin yang diekstrak dari tanaman ginseng menunjukkan aktivitas antimikroba pada beberapa bakteri antara lain Staphylococcus dan E. coli. Selain saponin, komponen flavonoid dan polifenol yang juga dapat diekstrak dengan pelarut metanol telah diketahui memiliki aktivitas antibakteri (Cowan 1999). Senyawa flavonoid merupakan senyawa yang disintesis sebagai respon dari tanaman saat terinfeksi mikroba (Gould dan Lyster 2006). Mekanisme penghambatan mikroba oleh senyawa flavonoid terdiri dari tiga cara antara lain menghambat sintesi asam nukleat, menghambat fungsi membran, dan menghambat metabolisme energi. Quercetin misalnya, yang merupakan salah satu golongan flavonol telah diketahui dapat menghambat DNA gyrase dari bakteri E. coli (Cushnie dan Lamb 2005). DNA gyrase merupakan enzim yang berperan dalam mengurangi tegangan ketika DNA induk terpisah menjadi dua untaian dalam proses replikasi DNA (Campbell dan Reece 2010). Penghambatan DNA gyrase akan menyebabkan proses replikasi DNA terhambat dan bakteri tidak dapat memperbanyak sel.
Komponen metabolit lainnya yaitu senyawa fenol sederhana dan asam fenolat mampu menghambat antibakteri dengan berikatan pada sel membran bakteri. Membran bakteri berfungsi memelihara integritas dari komponen-komponen seluler dalam sel dan berperan mengatur keluar masuknya bahan-bahan yang dibutuhkan oleh sel bakteri. Kerusakan pada membran sel dapat mengakibatkan terjadinya lisis sel atau mengganggu pertumbuhan sel bahkan mati (Denyer dan Stewart 1998).
Buah takokak diketahui positif mengandung komponen alkaloid dari berbagai tes kualitatif (Chah et al. 2000; Arif dan Fareed 2011; Kannan et al. 2012). Alkaloid merupakan komponen tanaman yang telah banyak digunakan sebagai bahan baku obat- obatan. Alkaloid dapat menghambat aktivitas antibakteri dengan berikatan dengan dinding sel dan DNA dari bakteri. Komponen alkaloid dari Sida acuta menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap bakteri Bacillus cereus, beberapa strain S. aureus dan beberapa strain E. coli (Karou2et al. 2005).
Ekstrak F2, F3, dan F4 memiliki nilai DIZ yang mirip yakni sebesar 5.5±0.15 mm, 5.6±0.54 mm, dan 5.6±0.26 mm. Pada tahap pengujian pertama ekstrak F5 memiliki nilai DIZ terendah dibanding ekstrak F1 hingga F4 dengan nilai 0.5 mm, pada tahap kedua F5 juga menunjukkan aktivitas yang terendah dibanding keempat ekstrak lainnya, namun diameter penghambatannya meningkat menjadi 3.4±1.33 mm. Pada ekstrak F2 hingga F5 ini pelarut yang digunakan saat ekstraksi adalah kombinasi dari metanol dan air dengan jumlah air yang semakin meningkat yang berarti semakin polar senyawa yang terekstrak. Air merupakan pelarut universal yang juga telah cukup banyak digunakan dalam analisis aktivitas antibakteri tanaman obat (Sivapriya et al. 2011; Gracelin et al. 2011). Walaupun senyawa fenol dan flavonoid bersifat polar, namun jika ekstraksi dilakukan menggunakan air efektivitas komponen tersebut sebagai antibakteri menjadi berkurang bahkan hilang (Ncube et al. 2008). Komponen fenol yang larut air ini tidak menunjukkan aktivitas antibakteri yang signifikan dan hanya menunjukkan aktivitas sebagai antioksidan (Tiwari et
al. 2011). Hal ini yang mungkin menyebabkan semakin bertambahnya jumlah air maka semakin menurun diameter penghambatan yang dihasilkan dari ekstrak buah takokak.
Hasil aktivitas antibakteri buah takokak terhadap Bacillus cereus pada penelitian ini lebih rendah dibandingkan dengan hasil pengujian aktivitas antibakteri buah takokak pada penelitian Chah et al. (2000) dan Sivapriya et al. (2011). Perbandingan hasil aktivitas antibakteri antara penelitian ini dan penelitian lainnya dapat dilihat pada Tabel 9.
Tabel 9. Perbandingan hasil aktivitas antibakteri penelitian dan referensi Variabel Hasil penelitian Chah et al. (2000) Sivapriya et al. (2011) Nilai diameter
penghambatan (mm) 7.1 16 21
Pelarut Metanol 100% Metanol 80% Etanol 50%
Bakteri uji B. cereus B. subtilis B. subtilis
Bagian buah Buah Buah Kulit buah
Tingkat kematangan Tua - -
Hal ini dapat disebabkan oleh beberapa faktor, salah satunya adalah jenis pelarut yang digunakan. Pelarut yang digunakan saat ekstraksi mempengaruhi hasil diameter penghambatan yang diperoleh karena pelarut dalam proses ekstraksi yang akan menentukan komponen metabolit yang terekstrak (Moco et al. 2007). Pada penelitian Chah et al. (2000) digunakan pelarut metanol 80% untuk mengekstrak tepung buah takokak hasil pengeringan matahari dan diperoleh nilai DIZ sebesar 16 mm dengan konsentrasi 80 mg/ml terhadap bakteri Bacillus subtilis. Selain itu, pada penelitian Sivapriya et al. (2011) nilai DIZ tertinggi yaitu 21 mm dihasilkan oleh ekstrak kulit buah takokak pada konsentrasi 10 mg/ml yang diekstrak dengan pelarut etanol:air (1:1) dalam pengujian terhadap bakteri Bacillus subtilis. Penggunaan bakteri uji yang berbeda ini juga mungkin menyebabkan perbedaan hasil yang diperoleh. Pengujian ketahanan terhadap antibiotik 75 strain dari enam spesies bakteri Bacillus menunjukkan bahwa perbedaan ketahanan antar spesies lebih besar dibandingkan perbedaan ketahanan diantara bakteri dalam satu spesies (Reva et al. 1995). Bacillus cereus tergolong ke dalam spesies bakteri Bacillus yang memiliki ukuran lebih besar (large-cell) sedangkan Bacillus subtilis tergolong ke dalam spesies yang berukuran kecil (small-cell) (Drobniewski 1993). Namun hingga saat ini belum ada penelitian mengenai pengaruh ukuran terhadap ketahanan bakteri sehingga belum dapat dipastikan bahwa ukuran sel dapat mempengaruhi ketahanan bakteri terhadap senyawa antibakteri.
Pada penelitian Sivapriya et al. (2011) dihasilkan nilai DIZ yang tinggi mungkin karena hanya bagian kulit buah takokak yang digunakan sedangkan pada penelitian Chah et al. (2001) dan penelitian ini yang digunakan adalah seluruh bagian buah takokak. Komponen flavonoid pada buah tomat yang juga merupakan famili Solanaceae seperti takokak berhasil diisolasi dari kulit buah tapi tidak ditemukan dalam daging buah. Komponen fenolik lain seperti p-kumarat, ferulat,asam kafeat, dan asam klorogenat juga ditemukan di dinding kulit buah dan hanya sedikit terdapat di bagian dalam buah (Hobson dan Davis 1971). Pada penelitian ini seluruh bagian buah digunakan sehingga bagian kulit buah, yang diduga lebih banyak mengandung komponen metabolit sekunder, lebih sedikit dibandingkan penelitian menggunakan kulit buahnya saja. Selain itu, buah takokak terdiri dari bagian epicarp, mesocarp, endocarp, biji, plasenta dan kolumella septa seperti yang terlihat pada Gambar 18. Biji buah takokak mengandung endosperm yang berisi cadangan
makanan untuk biji yang umumnya berupa karbohidrat, protein, dan lemak (Hidayat, 1995). Komponen makromolekul tersebut tidak memiliki aktivitas sebagai antibakteri bahkan gula merupakan bahan makanan bagi bakteri.
Perbedaan hasil pengujian aktivitas antibakteri juga mungkin akibat perbedaan tingkat kematangan buah takokak yang digunakan. Pada pengujian aktivitas antibakteri buah sawo yang merupakan famili Sapotaceae misalnya, diketahui bahwa tingkat kematangan yang buah yang berbeda mempengaruhi hasil diameter penghambatan terhadap bakteri uji. Pada penelitian buah sawo tersebut aktivitas antibakteri tertinggi terhadap bakteri Bacillus cereus diperoleh dari ekstrak metanol buah yang matang (Patel dan Rao 2012). Hal ini menunjukkan setiap tingkat kematangan buah dapat mengandung komponen metabolit yang berbeda dan mempengaruhi aktivitas antibakteri yang dihasilkan. Tomat yang merupakan famili Solanaceae seperti takokak memiliki kandungan polifenolik yang lebih banyak saat masih muda dan semakin matang buah tomat tersebut maka komponen polifenolik ini semakin menurun (vanBuren 1970). Pada penelitian ini buah takokak yang digunakan adalah buah yang tua namun belum matang sehingga kemungkinan komponen polifenolik yang terkandung dalam buah tersebut lebih sedikit dibanding dengan buah takokak yang masih muda. Padahal komponen fenolik ini merupakan komponen metabolit sekunder yang diduga berperan terhadap aktivitas antibakteri dari tanaman obat (Shan et al. 2007).
Perbedaan tingkat kematangan buah mempengaruhi kandungan komponen metabolit baik primer maupun sekunder sehingga dapat mempengaruhi aktivitas antibakteri yang dihasilkan. Komponen metabolit primer seperti karbohidrat, protein, dan lemak berperan dalam fungsi seluler tanaman, termasuk organ buah. Pada tomat yang merupakan famili Solanaceae seperti takokak, pati yang merupakan karbohidrat kompleks terdapat dalam jumlah yang cukup signifikan pada buah yang masih sangat muda namun jumlahnya semakin menurun dengan meningkatnya kematangan buah. Sebaliknya, gula pereduksi pada buah jumlahnya semakin meningkat selama proses pematangan (vanBuren 1970). Komponen metabolit primer lainnya seperi protein, secara umum akan semakin meningkat total protein nitrogennya selama proses kematangan (vanBuren 1970).
Komponen metabolit sekunder seperti senyawa fenolik umumnya akan terus menurun konsentrasinya seiringan dengan kematangan buah (vanBuren 1970). Komponen metabolit sekunder pada tanaman disintesis melalui tiga jalur utama yaitu shikimat, isoprenoid, dan poliketida. Jalur shikimat merupakan jalur utama yang menghasilkan senyawa aromatik. Jalur shikimat ini dimulai dengan kondensasi antara D-eritrosa 4-fosfat dan fosfoenolpiruvat. Selain menghasilkan komponen metabolit sekunder, komponen metabolit primer juga dapat dihasilkan melalui jalur shikimat ini (Verpoorte 2000). Secara umum
pada buah yang semakin matang jumlah kandungan gula pun akan semakin meningkat. Prekursor bagi komponen fenolik yaitu D-eritrosa 4-fosfat dan fosfoenolpiruvat merupakan turunan senyawa dari pemecahan gula (Scott 2008). Jumlah gula yang tinggi pada buah yang semakin matang akan membuat kandungan komponen fenolik menurun karena diduga gula yang ada tidak dipecah melalui jalur shikimat untuk menjadi prekursor bagi sintesis komponen fenolik melainkan digunakan sebagai cadangan energi dalam buah.
Sebanyak >20% metabolisme yang terjadi dalam sel terjadi melalui jalur fenilpropanoid. Jalur ini terutama penting dalam pembentukan komponen lignin, lignan, flavonoid, dan antosianin. Kunci utama dalam jalur fenilpropanoid ini adalah enzim PAL (phenylalanine ammonia lyase) yang mengubah fenilalanin menjadi trans-asam sinamat melalui deaminasi non-oksidatif. Sinamat dapat mengalami hidroksilasi atau metilasi sehingga menghasilkan senyawa fenol hidroksisinamat seperti asam kumarat, asam kafeat, asam ferulat, dan asam sinapit. Sinamat ini juga dapat berikatan dengan senyawa ester CoA menghasilkan senyawa coumaryl–CoA. Penggabungan antara coumaryl–CoA dan malonyl- CoA oleh enzim CHS (chalcone synthase) menghasilkan senyawa naringenin chalcone yang setelah diisomerasi lanjut akan menjadi naringenin yang merupakan kerangka utama bagi senyawa flavonoid (Verpoorte 2000).
Buah muda akan mengalami proses pembelahan dan pembesaran hingga menjadi buah yang tua dan matang (Hidayat 1995). Pada buah muda yang berkembang semakin lama kulit buah akan membelah dan membentuk jaringan-jaringan penyokong yang melindungi biji, begitu pula pada tanaman takokak. Pada kulit buah takokak terdapat bagian hipodermis diantara epidermis dan endodermis (Arif dan Fareed 2011). Umumnya, bagian hipodermis tanaman Solanum tersusun atas jaringan kolenkim yang mengandung lignin. Semakin tebal jaringan hipodermis maka semakin kuat konsistensi buah tersebut. Pada buah takokak yang berkembang dari buah muda menjadi tua lalu matang terjadi proses pembelahan sel dan pembesaran sel. Pembesaran sel dapat ditandai dengan jaringan hipodermis yang semakin menebal ke dalam dibanding ke luar (Chiarini et al. 2010). Penebalan jaringan hipodermis ini menyebabkan bertambahnya jumlah lignin yang dibutuhkan. Sinamat dan turunan hidroksinya dapat menjadi prekursor bagi pembuatan lignin dan lignan (Vepoorte 2000)