Antioksidan adalah komponen yang dapat menunda atau mencegah oksidasi lipid, asam nukleat, atau molekul-molekul lain, dengan cara menghambat inisiasi atau propagasi reaksi oksidasi berantai (Wang 2006). Keberadaan senyawa antioksidan ini dalam suatu bahan dapat dideteksi dengan melakukan uji aktivitas antioksidan. Uji aktivitas antioksidan pada tiga ekstrak kasar keong mas yang memiliki tingkat kepolaran yang berbeda, dilakukan dengan menggunakan metode uji DPPH.
Metode uji DPPH merupakan salah satu metode yang paling banyak digunakan untuk memperkirakan efisiensi kinerja dari substansi yang berperan sebagai antioksidan (Molyneux 2004). Metode pengujian ini berdasarkan pada kemampuan substansi antioksidan tersebut dalam menetralisir radikal bebas.
Radikal bebas yang digunakan adalah 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) (Vattem dan Shetty 2006). Radikal bebas DPPH merupakan radikal sintetik yang stabil pada suhu kamar dan larut dalam pelarut polar seperti metanol dan etanol (Molyneux 2004; Suratmo 2009). Sifat stabil ini dikarenakan radikal bebas ini
memiliki satu elektron yang didelokalisir dari molekul utuhnya, sehingga molekul tersebut tidak reaktif sebagaimana radikal bebas lain. Delokalisasi ini akan
memberikan sebuah warna ungu gelap dengan absorbansi maksimum pada 517 nm dalam larutan etanol ataupun metanol (Molyneux 2004; Amrun dan
Umiyah 2005; Vattem dan Shetty 2006).
Metode uji aktivitas antioksidan dengan menggunakan radikal bebas DPPH dipilih karena metode ini sederhana, mudah, cepat, peka dan hanya memerlukan sedikit sampel, akan tetapi jumlah pelarut pengencer yang diperlukan dalam pengujian ini cukup banyak. Metanol dipilih sebagai pelarut karena metanol dapat melarutkan kristal DPPH (Molyneux 2004; Suratmo 2009) dan juga memiliki sifat yang dapat melarutkan komponen non polar di dalamnya, mengingat ketiga ekstrak yang diuji memiliki tingkat kepolaran yang berbeda-beda.
Antioksidan pembanding yang digunakan pada penelitian ini adalah antioksidan sintetik BHT (butylated hydroxytoluene). Larutan BHT pada penelitian ini dibuat dengan konsentrasi 2, 4, 6 dan 8 ppm melalui proses pengenceran larutan stok BHT 250 ppm. Konsentrasi larutan ekstrak kasar keong
mas yang diuji dengan metode DPPH ini adalah sebesar 200, 400, 600 dan 800 ppm. Konsentrasi tersebut diperoleh melalui proses pengenceran dari
masing-masing larutan stok ekstrak kasar keong mas 1000 ppm. Perhitungan
pembuatan larutan stok dan proses pengencerannya dapat dilihat pada Lampiran 7.
Suatu senyawa dapat dikatakan memiliki aktivitas antioksidan apabila senyawa tersebut mampu mendonorkan atom hidrogennya pada radikal DPPH,
yang ditandai dengan perubahan warna ungu menjadi kuning pucat (Molyneux 20004). Perubahan warna ini hanya tampak pada larutan BHT yang
diberi larutan DPPH 1 mM dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 oC, sedangkan pada larutan ekstrak kasar keong mas yang telah diberi perlakuan sama tidak terlalu menunjukkan perubahan warna yang mencolok. Hal ini diduga karena konsentrasi ekstrak kasar keong mas yang diuji terlalu kecil dan jauh dari nilai konsentrasi ekstrak yang dapat meredam radikal DPPH sebanyak 50% (IC50).
Perubahan warna yang mengindikasikan adanya reaksi peredaman radikal bebas
DPPH oleh senyawa antioksidan pada larutan BHT dan larutan ekstrak keong mas, dapat dilihat pada Gambar 20.
BHT + DPPH 1 mM Ekstrak Kloroform + DPPH 1 mM
Ekstrak Etil Asetat + DPPH 1 mM Ekstrak Metanol + DPPH 1 mM Gambar 20. Perubahan warna yang mengidikasikan reaksi peredaman DPPH
Intensitas perubahan warna yang terjadi pada larutan BHT dan larutan ekstrak kasar keong mas ini dapat diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 517 nm. Setelah itu, perhitungan persen inhibisi dan IC50 dari antioksidan BHT dan masing-masing ekstrak kasar keong mas dapat dilakukan. Persen inhibisi adalah kemampuan suatu bahan untuk menghambat aktivitas radikal bebas, yang berhubungan dengan konsentrasi suatu bahan. IC50 sendiri merupakan salah satu parameter yang biasa digunakan untuk menginterpretasikan hasil dari pengujian DPPH. Nilai IC50 ini dapat didefinisikan sebagai konsentrasi substrat yang dapat menyebabkan berkurangnya 50% aktivitas DPPH. Semakin kecil nilai IC50 berarti aktivitas antioksidannya semakin tinggi (Molyneux 2004). Perhitungan persen inhibisi dan IC50 dapat
y = 14,32x - 20,34
dilihat pada Lampiran 8. Hasil uji aktivitas antioksidan BHT dan masing-masing ekstrak kasar keong mas dapat dilihat pada Tabel 7.
Tabel 7. Hasil uji aktivitas antioksidan
Sampel % Inhibisi IC50
Empat konsentrasi larutan BHT (2, 4, 6 dan 8 ppm) yang digunakan dalam penelitian ini dipilih berdasarkan hasil penelitian Hanani et al. (2005), dimana dengan menguji keempat konsentrasi tersebut, diperoleh nilai IC50 BHT sebesar 3,81 ppm. Pada penelitian ini, nilai IC50 BHT yang diperoleh sebesar 4,91 ppm.
Nilai IC50 BHT ini tidak jauh berbeda dengan nilai yang diperoleh Hanani et al. (2005) dalam penelitiannya, dan tetap menunjukkan bahwa
antioksidan BHT merupakan antioksidan dengan aktivitas yang sangat kuat (<50 ppm) menurut klasifikasi Blois (1958) dalam Molyneux (2004). Pengujian
aktivitas antioksidan BHT ini menghasilkan hubungan antara konsentrasi BHT yang digunakan dengan persen inhibisinya, yang dapat dilihat pada Gambar 21.
Gambar 21. Grafik hubungan konsentrasi BHT dengan persen inhibisinya Tabel 7 menunjukkan bahwa ketiga ekstrak kasar keong mas juga memiliki aktivitas antioksidan seperti BHT, walaupun aktivitasnya tergolong
lemah. Ketiga ekstrak kasar keong mas ini memiliki kekuatan penghambat yang berbeda-beda antara yang satu dengan yang lainnya. Pengujian aktivitas antioksidan dari masing-masing ekstrak kasar menghasilkan hubungan antara konsentrasi ekstrak kasar yang digunakan dengan persen inhibisinya, yang dapat dilihat pada Gambar 22.
Gambar 22. Grafik hubungan konsentrasi ekstrak kasar keong mas dengan rata-rata persen inhibisinya, ∆ = ekstrak metanol, □ = ekstrak etil asetat dan ◊ = ekstrak kloroform
Grafik pada Gambar 21 dan 22 merupakan kurva regresi linear yang digunakan untuk menentukan nilai IC50 dari BHT dan ketiga ekstrak keong mas.
Persamaan regresi linear secara umum adalah y = a + bx, dimana a merupakan intersep atau perpotongan dengan sumbu tegak, dan b merupakan kemiringan atau gradiennya (Walpole 1997). Grafik regresi linear umumnya digunakan untuk mengetahui hubungan fungsional (pengaruh atau meramalkan pengaruh) antara variabel yang mempengaruhi (lambang x) dan variabel yang dipengaruhi (lambang y) (Usman dan Akbar 2008). Variabel yang mempengaruhi pada kedua grafik (Gambar 21 dan 22) adalah konsentrasi, sedangkan variabel yang hubungan yang positif dan berkorelasi kuat (r), terihat dari nilai b pada persamaan
y = 0,014x - 0,238
3458,37 besar dari 0,90. Hal ini berarti semakin besar konsentrasinya maka semakin besar pula % inhibisi yang dihasilkan. Hubungan tersebut dibuktikan oleh data
% inhibisi yang meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi BHT atau ekstrak yang ditambahkan, seperti yang tertulis pada Tabel 7. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Hanani et al. (2005), yang menyatakan bahwa persentase penghambatan (persen inhibisi) terhadap aktivitas radikal bebas akan ikut meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi ekstrak. Hal serupa juga terjadi pada hasil pengujian aktivitas antioksidan BHT.
Positif atau negatifnya nilai a tidak akan memberikan pengaruh pada kemiringan atau arah kurva regresi linear yang dihasilkan, tetapi akan mempengaruhi besar nilai y yang dihasilkan (Lampiran 8 poin b dan c). Hal ini dikarenakan nilai a merupakan konstanta yang dapat menambah atau mengurangi nilai y yang akan diperoleh dan berperan sebagai faktor koreksi. Jika nilai a positif, maka setiap kenaikan 1 bagian nilai x akan menyebabkan nilai y bertambah sebanyak a, begitu pula sebaliknya. Positif atau negatifnya nilai a dapat disebabkan oleh adanya pencilan, adanya asumsi yang tidak terpenuhi, serta faktor-faktor lainnya.
Salah satu parameter yang biasa digunakan untuk menginterpretasikan hasil dari pengujian DPPH adalah efficient concentration 50 value (EC50 value) atau biasa dikenal dengan inhibition concentration 50 value (IC50 value) seperti yang disebutkan di atas. Nilai ini dapat didefinisikan sebagai konsentrasi substrat yang dapat menyebabkan berkurangnya 50% aktivitas DPPH (Molyneux 2004).
Nilai rata-rata IC50 ekstrak kasar keong mas dari ketiga pelarut yang digunakan, dapat dilihat pada Gambar 23.
Gambar 23. Nilai rata-rata IC50 ekstrak kasar keong mas
Semakin kecil nilai IC50 berarti aktivitas antioksidannya semakin tinggi (Molyneux 2004). Diagram batang pada Gambar 23 ini menunjukkan bahwa ekstrak metanol keong mas memiliki aktivitas antioksidan yang lebih besar dari dua ekstrak yang lainnya, ditandai dengan nilai IC50-nya yang terkecil, yaitu 1270,47 ppm. Sedangkan, ekstrak kloroform keong mas merupakan ekstrak yang memiliki aktivitas antioksidan yang paling lemah. Hal ini terbukti dari nilai IC50 -nya yang terbesar, yaitu 3458,37 ppm.
Walaupun rendemen ekstrak etil asetat lebih sedikit dari rendemen kloroform, tetapi aktivitas antioksidannya lebih kuat. Hal ini diduga karena pada ekstrak etil asetat terdapat komponen flavonoid yang terdeteksi melalui uji fitokimia, sedangkan pada ekstrak kloroform tidak. Flavonoid diketahui sangat
efektif untuk digunakan sebagai antioksidan (Astawan dan Kasih 2008).
Peran flavonoid sebagai antioksidan ini terbukti dari hasil penelitian Bernardi et al. (2007) yang menunjukkan bahwa seluruh komponen flavonoid
yang diisolasi dari tumbuhan Hypericum ternum memiliki aktivitas antioksidan.
Komponen flavonoid pada ekstrak metanol keong mas juga terdeteksi, akan tetapi aktivitas antioksidannya lebih kuat dari ekstrak etil asetat keong mas.
Hal ini diduga karena pada ekstrak metanol keong mas juga terkandung komponen alkaloid. Alkaloid juga telah diketahui memiliki aktivitas antioksidan.
Hal ini terbukti dari hasil penelitian Porto et al. (2009), yang menunjukkan bahwa komponen alkaloid pada daun Psychotria brachyceras yaitu brachycerine,
memiliki aktivitas antioksidan dan berperan sebagai pelindung dari radiasi sinar UV (UV-B dan UV-C).
Suatu senyawa dikatakan sebagai antioksidan sangat kuat apabila nilai IC50
kurang dari 0,05 mg/ml, kuat apabila nilai IC50 antara 0,05-0,10 mg/ml, sedang apabila nilai IC50 berkisar antara 0,10-0,15 mg/ml, dan lemah apabila nilai IC50
berkisar antara 0,15-0,20 mg/ml (Blois 1958 dalam Molyneux 2004). Menurut klasifikasi ini, ketiga esktrak kasar keong mas tersebut memiliki aktivitas antioksidan yang sangat lemah, karena nilai IC50-nya lebih besar dari 0,20 mg/ml atau 200 ppm. Hal ini jauh berbeda dengan aktivitas antioksidan BHT.
Data-data pada Tabel 7 menunjukkan bahwa antioksidan BHT memiliki aktivitas yang lebih kuat dari senyawa-senyawa antioksidan yang terdapat pada
ketiga ekstrak kasar keong mas. Hal ini terlihat dari nilai IC50 BHT yang jauh berbeda dengan nilai IC50 dari masing-masing ekstrak kasar keong mas. Nilai IC50 antioksidan BHT jauh lebih kecil dari nilai IC50 ketiga ekstrak kasar keong mas. Hal ini dapat terjadi karena ekstrak keong mas yang digunakan dalam pengujian ini masih tergolong sebagai ekstrak kasar (crude). Ekstrak kasar ini masih mengandung senyawa lain yang bukan merupakan senyawa antioksidan.
Senyawa lain tersebut ikut terekstrak dalam pelarut selama proses ekstraksi.
Senyawa-senyawa ini dapat meningkatkan nilai rendemen ekstrak, tetapi tidak dapat meningkatkan aktivitas antioksidan ekstrak tersebut. Senyawa murni dari ekstrak kasar ini diduga memiliki aktivitas antioksidan yang lebih tinggi.
Contohnya adalah komponen flavonoid yang terdeteksi pada ekstrak etil asetat dan ekstrak metanol. Komponen flavonoid murni dari ekstrak keong mas diduga memiliki aktivitas antioksidan yang jauh lebih tinggi dari ekstrak kasarnya. Hal ini menunjukan bahwa perlu dilakukan pemurnian pada ekstrak kasar keong mas tersebut. Setelah ekstrak yang telah dimurnikan tersebut diperoleh, maka pengujian aktivitas antioksidannya pun perlu dilakukan.
Ekstrak kloroform keong mas yang bersifat non polar tidak sepenuhnya benar jika dinyatakan memiliki aktivitas antioksidan yang paling lemah, walaupun hasil pengujian dengan metode DPPH menunjukan bahwa nilai IC50-nya cukup besar. Hal ini daqpat terjadi apabila pelarut yang digunakan untuk melarutkan ekstrak, memiliki sifat kepolaran yang berbeda dengan ekstrak tersebut. Pelarut yang digunakan untuk melarutkan ekstrak dan kristal DPPH pada penelitian ini adalah metanol yang bersifat polar, sehingga diduga komponen bioaktif yang bersifat non polar pada ekstrak kloroform tidak terlarut sepenuhnya pada pelarut ini, baik pada ulangan 1 ataupun ulangan 2. Jumlah komponen bioaktif yang terlarut pun pada masing-masing ulangan akan berbeda dan pada akhirnya akan berpengaruh pada nilai IC50 yang dihasilkan dari masing-masing ulangan. Hal ini terbukti dari nilai IC50 ekstrak kloroform pada Tabel 7, dimana selisih nilai IC50
antara ulangan 1 dan ulangan 2 sangat besar yang tentunya juga akan memperbesar nilai standar deviasinya. Nilai IC50 akan semakin besar jika ekstrak yang terlarut pada pelarut yang digunakan semakin sedikit. Hal ini mengisyaratkan bahwa perlu dilakukan pengujian aktivitas antioksidan dengan
menggunakan metode pengujian lainnya yang universal, baik untuk komponen bioaktif yang bersifat polar, semipolar, ataupun non polar. Metode uji DPPH merupakan metode pengujian aktivitas antioksidan yang paling cocok bagi komponen antioksidan yang bersifat polar, karena kristal DPPH hanya dapat larut dan memberikan absorbansi maksimum pada pelarut etanol ataupun metanol seperti yang dikemukakan oleh Molyneux (2004); Amrun dan Umiyah (2005);
serta Vattem dan Shetty (2006).