4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.3 Aktivitas Antioksidan
Senyawa antioksidan dalam suatu bahan dapat diketahui dengan melakukan uji aktivitas antioksidan. Pengujian aktivitas antioksidan pada ekstrak kloroform, etil asetat, dan metanol semanggi air dilakukan menggunakan metode DPPH. DPPH (diphenylpicrylhydrazyl) adalah suatu radikal bebas stabil yang dapat bereaksi dengan radikal lain membentuk senyawa yang lebih stabil. Selain itu, DPPH juga dapat bereaksi dengan atom hidrogen membentuk DPPH tereduksi (diphenylpicrylhydrazyl) yang stabil (Molyneux 2004).
Metode DPPH adalah salah satu metode yang paling banyak digunakan untuk memperkirakan efisiensi kinerja dari substansi yang berperan sebagai antioksidan (Molyneux 2004). Metode ini dipilih karena sederhana, mudah, cepat, peka dan hanya memerlukan sedikit sampel, akan tetapi jumlah pelarut pengencer yang diperlukan dalam pengujian ini cukup banyak.
Antioksidan pembanding yang digunakan pada penelitian ini adalah antioksidan sintetik BHT. BHT dalam penelitian ini dibuat dengan konsentrasi 2, 4, 6, dan 8 ppm. Konsentrasi tersebut diperoleh dari hasil pengenceran stok BHT dengan konsentrasi 250 ppm. Konsentrasi ekstrak kasar semanggi air yang digunakan pada metode DPPH ini adalah 200, 400, 600, dan 800 ppm. Konsentrasi tersebut diperoleh melalui proses pengenceran dari setiap larutan stok ekstrak kasar semanggi air 1000 ppm. Perhitungan pembuatan larutan stok dan proses pengencerannya dapat dilihat pada Lampiran 3.
Suatu senyawa dapat dikatakan memiliki aktivitas antioksidan apabila senyawa tersebut mampu mendonorkan atom hidrogennya pada radikal DPPH,
yang ditandai dengan perubahan warna ungu menjadi kuning pucat (Molyneux 20004). Berdasarkan hasil penelitian, perubahan warna ini hanya
tampak pada larutan BHT yang diberi larutan DPPH 1 mM dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 oC, sedangkan pada larutan ekstrak kasar semanggi air yang telah diberi perlakuan sama tidak terlalu menunjukkan perubahan warna yang mencolok. Hal ini diduga karena konsentrasi ekstrak kasar semanggi air yang diuji terlalu kecil dan jauh dari nilai konsentrasi ekstrak yang dapat meredam
30 radikal DPPH sebanyak 50% (IC50). Perubahan warna yang mengindikasikan adanya reaksi peredaman radikal bebas DPPH oleh senyawa antioksidan pada larutan BHT dan larutan ekstrak semanggi air dapat dilihat pada Gambar 6.
BHT + DPPH 1 mM Ekstrak Etil Asetat + DPPH 1 mM
Ekstrak Kloroform+ DPPH 1 mM Ekstrak Metanol + DPPH 1 mM Gambar 6 Perubahan warna yang mengidikasikan reaksi peredaman DPPH
Larutan BHT dan larutan ekstrak semanggi air kemudian dilihat intensitas warnanya dengan menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 517 nm yang akan menghasilkan nilai absorbansi. Nilai absorbansi tersebut diolah untuk menghasilkan persen inhibisi dan IC50 dari antioksidan BHT dan masing-masing ekstrak kasar semanggi air dapat dilakukan. Persen inhibisi adalah kemampuan suatu bahan untuk menghambat aktivitas radikal bebas, yang berhubungan dengan konsentrasi suatu bahan. Nilai IC50 diartikan sebagai konsentrasi substrat yang dapat menyebabkan berkurangnya 50% aktivitas DPPH. Semakin kecil nilai IC50 berarti aktivitas antioksidannya semakin tinggi (Molyneux 2004). Perhitungan persen inhibisi dan IC50 dapat dilihat pada
31 Lampiran 4. Hasil uji aktivitas antioksidan BHT dan berbagai ekstrak kasar semanggi air dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2 Hasil uji aktivitas antioksidan
Sampel % Inhibisi IC50 (ppm) BHT 2 ppm 4 ppm 6 ppm 8 ppm 4,91 12,55 23,67 79,37 89,45 200 ppm 400 ppm 600 ppm 800 ppm Ekstrak Kloroform 29,56 33,00 37,07 40,74 1285,39 Ekstrak Etil Asetat 34,39 40,22 44,38 47,12 915,03 Ekstrak Metanol 42,95 44,33 49,99 53,63 634,73
Hasil pengujian aktivitas antioksidan menunjukkan BHT memiliki nilai IC50 sebesar 4,91 ppm. Semakin kecil nilai IC50 maka semakin tinggi aktivitas antioksidannya. Persentase penghambatan tinggi dan nilai IC50 yang rendah membuktikan bahwa BHT bersifat sebagai antioksidan yang kuat. BHT itu sendiri merupakan antioksidan sintetik. Antioksidan sintetik ini biasa dicampurkan ke dalam bahan pangan karena efektif menghambat aktivitas radikal bebas dan bersifat sinergis dengan antioksidan lainnya. Namun penggunaan antioksidan sintetik dapat menyebabkan keracunan pada dosis tertentu. Kadar maksimum BHT dalam bahan pangan adalah 200 ppm (Ketaren 1986). Pengujian aktivitas antioksidan BHT menghasilkan hubungan konsentrasi BHT yang digunakan dengan persen inhibisinya yang dapat dilihat pada Gambar 7.
32 Gambar 7 menunjukkan bahwa BHT memiliki persen penghambatan radikal bebas tertinggi pada konsentrasi 8 ppm, yaitu sebesar 89,45% dengan nilai IC50 sebesar 4,91 ppm. Nilai IC50 BHT ini tidak jauh berbeda dengan nilai yang diperoleh Hanani et al. (2005) dalam penelitiannya sebesar 3,81 ppm. Contoh perhitungan persentase penghambatan dan nilai IC50 dapat dilihat pada Lampiran 4. Aktivitas antioksidan dapat dikatakan tinggi bila nilai IC50 yang diperoleh kecil. Persentase penghambatan tinggi dan nilai IC50 yang kecil membuktikan bahwa BHT bersifat antioksidan yang sangat kuat (<50 ppm) menurut klasifikasi Blois (1958) dalam Molyneux (2004).
Berdasarkan hasil perhitungan, rata-rata kemampuan menghambat radikal bebas terendah terdapat pada konsentrasi 200 ppm, yaitu 29,56% untuk ekstrak kloroform, 34,39% untuk ekstrak etil asetat, 42,95% untuk ekstrak metanol. Sedangkan rata-rata kemampuan menghambat radikal bebas tertinggi terdapat pada konsentrasi 800 ppm, yaitu 40,74% untuk ekstrak kloroform, 47,38% untuk ekstrak etil asetat, 53,63% untuk ekstrak metanol. Semakin tingginya konsentrasi ekstrak kasar semanggi air yang digunakan menghasilkan persentase penghambatan radikal bebas yang tinggi pula. Hal ini sesuai dengan penelitian yang telah dilakukan oleh Qian dan Nihorimbere (2004), yang menyatakan bahwa persentase penghambatan terhadap aktivitas radikal bebas meningkat dengan meningkatnya konsentrasi ekstrak.
Ekstrak kasar kloroform, etil asetat, dan metanol semanggi air memiliki aktivitas antioksidan walaupun aktivitasnya tergolong rendah. Hal ini dapat dilihat dari nilai IC50 yang tinggi ketiga ekstrak kasar semanggi air. Ekstrak ini memiliki kekuatan penghambat yang berbeda-beda. Hubungan persentase penghambatan dengan konsentrasi ekstrak kasar semanggi air disajikan pada Gambar 8.
33 Gambar 8 Hubungan konsentrasi dengan rata-rata persentase penghambatan
ekstrak kasar semanggi air.
IC50 dapat didefinisikan sebagai konsentrasi substrat yang dapat menyebabkan berkurangnya 50% aktivitas DPPH (Molyneux 2004). Nilai
rata-34 rata IC50 pada ekstrak kasar semanggi air dari ketiga pelarut yang digunakan, dapat dilihat pada Gambar 9.
Gambar 9 Nilai rata-rata IC50 ekstrak kasar semanggi air
Gambar 9 menunjukkan bahwa metanol memiliki aktivitas antioksidan paling baik, dimana sebesar 50% radikal bebas DPPH berhasil dihambat aktivitasnya pada konsentrasi 634,73 ppm, diikuti oleh konsentrasi ekstrak etil asetat sebesar 915,03 ppm dan konsentrasi ekatrak kloroform sebesar 1285,39 ppm. Nilai IC50 yang rendah mengindikasikan aktivitas antioksidan yang tinggi.
Blois (1958) dalam Molyneux (2004) menjelaskan bahwa, suatu senyawa dapat dikatakan sebagai antioksidan sangat kuat apabila nilai IC50 kurang dari 0,05 mg/ml, kuat apabila nilai IC50 antara 0,05-0,10 mg/ml, sedang apabila nilai IC50 berkisar antara 0,10-0,15 mg/mldan lemah apabila nilai IC50 berkisar antara 0,15-0,20 mg/ml. Menurut klasifikasi ini, ketiga esktrak kasar semanggi air tersebut memiliki aktivitas antioksidan yang sangat lemah, karena nilai IC50-nya lebih besar dari 0,20 mg/ml atau 200 ppm. Aktivitas antioksidan ini jauh berbeda dengan antioksidan sintetik BHT karena ekstrak semanggi air yang digunakan pada pengujian masih berupa ekstrak kasar (crude). Ekstrak kasar bukan merupakan senyawa murni, tetapi masih mengandung senyawa-senyawa lain yang kemungkinan tidak mempunyai aktivitas antioksidan.
Kebayakan senyawa antioksidan yang diisolasi dari sumber alami berasal dari tumbuhan. Senyawa ini umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik
634,73 1285,39
915,03
35 yang dapat berupa golongan flavonoid, turunan asam sinamat, kumarin dan tokoferol (Pratt dan Hudson 1990). Komponen flavonoid hasil pengujian terdapat pada ekstrak kasar metanol, etil asetat, dan kloroform semanggi air. Peran flavonoid sebagai antioksidan ini terbukti dari hasil penelitian Ayoola et al. (2008) yang menunjukkan bahwa seluruh komponen flavonoid yang diisolasi dari tumbuhan C. papaya, M. indica, V. amygdalina, dan P. guajava memiliki aktivitas antioksidan.
Ekstrak kasar metanol semanggi air memiliki aktivitas antioksidan yang lebih kuat dibandingkan dengan ekstrak kasar etil asetat dan kloroform. Ekstrak kasar metanol semanggi air diduga mengandung komponen alkaloid. Alkaloid diketahui memiliki aktivitas antioksidan. Ayoola et al. (2008) menunjukkan bahwa C. papayadan dan V. amygdalina mengandung komponen alkaloid yang memiliki berpotensi memiliki aktivitas antioksidan. Setiap pelarut yang berbeda sifat kepolarannya melarutkan komponen-komponen bioaktif yang berbeda. Suratmo (2007) menyatakan bahwa golongan senyawa-senyawa fenolat, flavonoid, dan alkaloid berpotensi sebagai antioksidan yang merupakan senyawa-senyawa polar. Senyawa-senyawa-senyawa polar tersebut akan terekstrak pada fraksi ekstrak metanol karena metanol pelarut yang polar. Fraksi ekstrak etilasetat terdapat senyawa-senyawa dengan kepolaran yang sedang dan memungkinkan juga mengekstrak sebagian kecil senyawa polar yang memiliki aktivitas antioksidan. Ekstrak kasar kloroform semanggi air memiliki aktivitas antioksidan yang lemah dibandingkan kedua ekstrak lainnya. Fraksi ekstrak kloroform kemungkinan hanya mengandung senyawa non polar, seperti minyak atsiri, lemak, dan minyak.