METODOLOGI PENELITIAN
3.9 Alat dan Bahan .1 Alat
1. Kandang tikus individual beserta perlengkapannya
2. Timbangan hewan percobaan OHAUS dan timbangan analitik 3. Sonde lambung ukuran kecil
4. Alat pembuatan jus buah pepaya : juicer, filter, botol kaca biasa, pipet 5. Alat alat untuk pembuatan sediaan histologi aorta abdominalis
3.9.2 Bahan
1. Emulsi kuning telur 5 mg/200 gr.
3. Buah pepaya lokal yang matang untuk bahan pembuatan jus buah pepaya.
3.10 Rancangan Penelitian
3.10.1 Persiapan Hewan Percobaan.
Tikus dipelihara dalam kandang plastik dengan anyaman kawat sebagai penutup. Kandang ditempatkan dalam ruangan yang memiliki ventilasi dan mendapat cahaya matahari secara tak langsung. Kandang, tempat makan dan minum dibersihkan sedikitnya tiga kali dalam seminggu. Sebelum perlakuan, tikus diaklitimasi selama satu minggu. Pemberian makan dan minum dilakukan setiap hari secara ad libitum. Pakan yang diberikan berupa pakan tikus standar CP 551 serta air minum aquades. Sampel yang terdiri dari 25 ekor tikus jantan dibagi secara acak dalam 5 kelompok masing-masing 5 ekor tiap kelompok. Setiap kelompok diberi kode kelompok I, II, III, IV, V.
Perlakuan diberikan sesuai dengan kelompoknya. Sebelum perlakuan dilakukan penimbangan berat badan sebagai data dasar. Bahan uji diberikan secara oral dengan menggunakan sonde yaitu alat suntik dengan jarum yang ujungnya ditumpulkan. Sonde dimasukkan dengan hati-hati sampai kira-kira mencapai lambung. Waktu pemberian bahan uji diusahakan tetap antara pukul 09.00 WIB-sampai dengan pukul 10.00 WIB. Volume pemberian bahan uji adalah sesuai dosis yang telah diperhitungkan.
3.10.2 Perhitungan Dosis Perlakuan
Dosis jus buah pepaya adalah dosis tunggal 2,6 gr/ml setiap tikus setiap hari.
Dosis ini Menurut Sri (2006) bahwa kebutuhan manusia akan buah pepaya per hari
adalah sebanyak 100 gram. Kusumawati (2004) menyatakan bahwa faktor konversi dari manusia ke tikus dengan berat badan untuk manusia 70 kg dan berat badan tikus wistar 200 gram adalah 0,026. Jadi 100 g x 0,026 = 2,6 g. Jus buah pepaya diberikan melalui sonde lambung sekali setiap hari. Skala nominal, dengan nilai 1 jika diberi diet jus buah pepaya dan 0 jika tidak diberi jus buah papaya. Variasi pemberian jus pepaya pada kelompok kontrol dan perlakuan adalah dosis 2,6 gr/ekor/hari hasil konversi dosis pada manusia diberikan selama 2 minggu dan 4 minggu diberikan melalui sonde lambung.
3.10.3 Persiapan Pakan Standar
Pakan standar menggunakan pakan standar berdasarkan diet untuk rodentia dari CP 551. Ransum pakan standar adalah makanan bagi semua tikus selama penelitian. Pakan standar diberikan selama satu minggu adaptasi hewan percobaan.
3.10.4 Persiapan Diet Kuning Telur
Pembuatan diet kuning telur dilakukan dengan cara; 1) pisahkan kuning telur dari putih telur, 2) kocok kuning telur perlahan untuk mendapatkan
emulsinya. Pemberian kuning telur 5 gram/ 200 gr BB dilakukan pada semua tikus kecuali kelompok kontrol negatif dan mulai hari kedelapan sampai dengan hari terakhir perlakuan, sebelum didekapitasi (Prasetyo A et al,2004; Fadhilah A, Prasetyo A,2001; Sampurno A, 2003).
3.10.5 Pembagian Kelompok dan Pemberian Perlakuan
Pada hari ke-8, setelah masa aklitimasi selama 1 minggu,kemudian dibagi secara random sederhana dilakukan pembagian menjadi 5 kelompok yang masing-masing terdiri atas minimal lima ekor tikus dan masing-masing kelompok diberi perlakuan yang berbeda, sebagai berikut :
a. Kelompok I atau K1 (kelompok kontrol negatif), adalah kelompok sample yang hanya diberi diet standar selama 2 minggu kemudian diambil sampel darah venanya untuk mengukur kadar LDL dan kadar kolesterol total-nya kemudian didekapitasi di hari ke 15, untuk melihat gambaran histopatologis aorta abdominalisnya yang dianggap sebagai gambaran histopatologis aorta abdominalis yang normal.
b. Kelompok II atau K2 (kelompok kontrol positif), diberi pakan standar dan diet kuning telur saja selama dua minggu kemudian diberi diet standar selama dua minggu lalu di hari ke-29 diambil sampel darah venanya untuk mengukur kadar LDL dan kadar kolesterolnya kemudian didekapitasi untuk melihat gambaran histopatologis aorta abdominalisnya yang dianggap sebagai gambaran histopatologis lesi fatty streak aorta abdominalis.
c. Kelompok III atau P1 (kelompok perlakuan 1), diberi pakan standar dan diet kuning telur selama dua minggu kemudian diberi diet standar dan jus buah pepaya selama dua minggu berikutnya, lalu di hari ke-29 diambil sampel darah venanya untuk mengukur kadar LDL dan kadar kolesterolnya kemudian didekapitasi untuk melihat gambaran histopatologis lesi fatty streak aorta abdominalis kelompok kontrol perlakuan 1.
d. Kelompok IV atau P2 (kelompok perlakuan 2), diberi pakan standar dan diet tinggi kolesterol selama dua minggu kemudian diberi diet standar dan jus buah pepaya selama empat minggu berikutnya,lalu di hari ke-43 diambil sampel darah venanya untuk mengukur kadar LDL dan kadar kolesterolnya kemudian didekapitasi untuk melihat gambaran histopatologis lesi fatty streak aorta abdominalis kelompok kontrol perlakuan 2.
e. Kelompok V atau P3 (kelompok perlakuan 3), diberi pakan standar dan diet kuning telur selama dua minggu kemudian diberi diet standar dan jus buah pepaya selama 8 minggu dan di hari ke-57 diambil sampel darah venanya untuk mengukur kadar LDL dan kadar kolesterolnya kemudian didekapitasi untuk melihat gambaran histopatologis lesi fatty streak aorta abdominalis kelompok kontrol perlakuan 3.
3.10.6 Pemberian jus Buah Pepaya
Jus buah pepaya dibuat dengan menggunakan alat juicer dari bahan daging buah papaya yang diblender menjadi sangat halus kemudian di saring dan
ditampung setelah itu diberikan ke sampel percobaan sesuai dosis yang telah ditentukan sekali dalam sehari dengan menggunakan sonde lambung.
3.10.7 Penghitungan Jumlah Sel Busa
Penghitungan jumlah sel busa dilakukan dengan menghitung dari irisan penampang melintang aorta abdominalis yang diproses dan dipulas dengan pewarnaan Hematoksilin-Eosin. Pewarnaan HE dilakukan dengan cara sebagai berikut; 1) sisa jaringan aorta abdominalis difiksasi dalam larutan formalin buffer 10 % selama 18 – 24 jam, lalu dimasukkan ke dalam larutan aquades selama 1 jam untuk menghilangkan larutan fiksasi, 2) jaringan didehidrasi dengan larutan alkohol bertingkat dari konsetrasi 30%, 50%, 70%, 80%, 90% sampai alkohol absolut, 3) jaringan dimasukan ke dalam larutan alkohol-xylol selama 1 jam, diteruskan ke larutan xylol murni selama dua kali dua jam, 4) jaringan diimpregnasi dengan paraffin cair (histoplast) selama dua kali dua jam, 5) embedding jaringan dilakukan ke dalam blok, 6) jaringan dipotong dalam blok parafin dengan mikrotom, setebal 4 mikron, 7) irisan potong beku diletakan pada kaca obyek yang sebelumnya telah diolesi poly-l-lisin, pencairan dan pembuangan parafin dari irisan jaringan dilakukan dengan pemanasan dalam inkubator, 8) kemudian dilakukan deparafinasi, 9) setelah bersih, dilakukan pemulasan dengan pewarnaan rutin HE, dan setelah kering diberi balsam Canada dan ditutup dengan kaca penutup. Sel busa dilihat di bawah mikroskop cahaya dengan pembesaran 1000 X dan hitung jumlah sel busa di tunika intima dan tunika media pada penampang melintang aorta.
3.10.8 Pengukuran Ketebalan Dinding Aorta Abdominalis
Pengukuran ketebalan dinding aorta abdominalis dilakukan dengan cara yang sama seperti pada proses penghitungan jumlah sel busa, sebagai berikut; 1) tikus didekapitasi dan diambil aorta abdominalis sepanjang 5 cm, 2) jaringan aorta abdominalis difiksasi dalam larutan formalin buffer 10 % selama 18 – 24 jam, lalu dimasukkan kedalam larutan aquades selama 1 jam untuk menghilangkan larutan fiksasi, 3) jaringan didehidrasi dengan larutan alkohol bertingkat dari konsetrasi 30%, 50%, 70%, 80%, 90% sampai alkohol absolut, 4) jaringan dimasukan ke dalam larutan alkohol-xylol selama 1 jam, diteruskan ke larutan xylol murni selama dua kali dua jam, 5) jaringan diimpregnasi dengan paraffin cair (histoplast) selama dua kali dua jam, 6) embedding jaringan dalam blok parafin, 7) jaringan dipotong dalam blok parafin dengan mikrotom setebal 4 mikron. 8) irisan potong beku diletakan pada kaca obyek yang sebelumnya telah diolesi poly-l-lisin. Pencairan dan pembuangan parafin dari irisan jaringan dilakukan dengan pemanasan dalam inkubator, 9) dilakukan deparafinasi, 10) setelah bersih dilakukan pemulasan dengan pewarnaan rutin HE, setelah selesai beri balsam Canada dan ditutup dengan kaca penutup, 11) ketebalan aorta abdominalis diukur di bawah mikroskop cahaya dengan pembesaran 400 X, 12) ketebalan dinding aorta diukur dari tunika intima sampai adventitia pada delapan zona yaitu zona jam 12.00, 13.30, 15.00, 16.30, 18.00, 19.30, 21.00, 22.30, 13) cara penghitungannya adalah (jumlah skala rerata pengukuran delapan zona : 400) X 1000 mikron, atau jumlah rata-rata skala pengukran delapan zona X 2,5 mikron.
3.11 Cara Pengolahan Data