METODOLOGI PENELITIAN
3.3. Sampel Penelitian dan Populasi
3.5.4. Alur Penelitian Pengukuran Kadar Katalase
Siapkan organ jantung tikus yang akan dibuat menjadi homogenat, dan tetap dibiarkan dalam suhu dingin dengan dimasukkan ke dalam cooler box. Lalu, siapkan larutan buffer, timbangan analitik, kaca wadah, microtip, dan wadah penampung homogenat (microtube).
3.5.4.1. Penimbangan Bobot Total Organ
Organ jantung tikus ditimbang menggunakan timbangan analitik, dan dicatat masing-masing sampel berurutan dengan kode perlakuan.
3.5.4.2. Pengambilan Jaringan
Organ jantung tikus yang telah ditimbang dan dicatat, dipotong menggunakan pisau cutter hingga berbobot 50 miligram tiap sampel, lalu dimasukan kedalam microtube yang sesuai dengan kode sampel masing-masing tikus.
3.5.4.3. Pembuatan Homogenat Jaringan
Masukkan organ yang telah dipotong berukuran 0,05 gram ke dalam
microtube, lalu beri larutan PBS pH 7,4 sebanyak 1000 mikroliter menggunakan
micropipet, dan homogenisasi dengan menghancurkan menggunakan spatula. Simpan wadah di tempat yang dingin yang bersuhu -70C. Langkah berikutnya dilakukan pengukuran aktivitas Katalase (CAT).
3.5.4.4. Pengukuran Kadar Protein
Pengukuran kadar protein menggunakan nanodrop di laboratorium Biologi FK UIN, dan dimulai dengan persiapan alat yaitu nanodrop, micropipette,
microtube, microtip. Dan siapkan bahannya yaitu alcohol swab, tissue,
akuabidest, larutan PBS pH 7, dan sampel homogenat. Pengukuran dimulai dengan menyalakan nanospektrofotometer, lalu memilih software uji protein. Kemudian bersihkan nanodrop dengan aquabidest dan tutup dengan tissue. Pada nanodrop, klik blank, lalu tambahkan sampel yang akan diuji pada nanodrop sebanyak 1 L menggunakan mikropipet. Lalu klik measure pada nanodrop, dengan panjang gelombang 280 nm, dan catat berapa jumlah protein pada
masing-masing organ sesuai dengan kode sampel. Setelah selesai digunakan, bersihkan kembali nanodrop menggunakan aquabidest dan tutup software, dan matikan alat nanodrop. (Lampiran 4).
3.5.4.5. Pengukuran Aktivitas Katalase (CAT)
Pengukuran kadar katalase dimulai dengan mencairkan homogenat organ jantung tikus yang telah dibuat, dengan tetap didiamkan dalam suhu dingin di dalam cooler box. Lalu, dengan menggunakan mikropipet, masukkan tiap homogenat sebanyak 50 l ke dalam kuvet, lalu ditambahkan dengan larutan PBS sebanyak 50 l, dan diberi larutan H2O2 sebanyak 950 l. Masukkan ke dalam spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 240 nm dan hitung aktivitas katalase pada menit ke 0, 1, 2, dan 3. (Lampiran 5).
3.5.4.6. Analisis Data
Data pengukuran katalase yang telah tercatat dilakukan uji kemaknaannya dengan menggunakan program statistik SPSS versi 23. Pengujian dimulai dengan uji normalitas Shapiro-Wilk, diikuti uji homogenitas Levene. Jika data terdistribusi normal dan data memiliki varians yang sama, maka dapat dilakukan uji one way ANOVA. Jika data tidak terdistribusi normal dan varians tidak sama, maka dilakukan uji transformasi data. Jika pada uji normalitas dan homogenitas data tidak terdistribusi normal dan varians data tidak sama, maka dilakukan uji Kruskal-Wallis. Lalu, dilakukan pengukuran untuk membandingkan kemaknaan antar kelompok menggunakan uji Mann-Whitney.
3.5.5. Alur Pembuatan Preparat Histologi Jaringan Jantung 3.5.5.1. Fiksasi Jaringan
Tujuan dari fiksasi adalah untuk mempertahankan struktur dari jaringan agar tidak rusak. Fiksasi dapat dilakukan dengan cara yaitu menggunakan bahan kimia dan dengan menggunakan suhu. Pada penelitian ini, metode yang digunakan adalah dengan menggunakan bahan kimia yaitu formalin 10%. Lakukan pemotongan organ menggunakan pisau cutter, lalu masukkan potongan organ yang telah dibuat ke dalam cairan formalin 10%, dan diberi tambahan
larutan Phosphate-Buffered-Saline (PBS) dengan pH 7,4 sebagai penyangga agar mempertahankan integritas sel yang terdapat di dalam jaringan. Jaringan harus terlarut di dalam botol dengan perbandingan 1:20. Beri nama pada botol yang telah berisi organ dan larutan sesuai kode masing-masing tikus. Simpan jaringan di dalam suhu ruangan minimal dua jam.
3.5.5.2. Dehidrasi
Proses dehidrasi dilakukan menggunakan alkohol yang memiliki konsentrasi yang bervariasi, yaitu 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, dan alkohol absolut. Lalu dilakukan penempatan dari setiap alkohol yang telah memiliki konsentrasi berbeda-beda ke dalam botol kaca. (Lampiran 7). Tiap larutan yang telah dibuat dengan varian konsentrasi dimasukkan ke tiga buah botol, dan diberi label I, II, dan III untuk mengurutkan proses dehidrasi. Tahap dehidrasi dimulai dari memasukkan potongan organ jantung ke dalam larutan dengan konsentrasi alkohol paling rendah hingga ke yang tinggi, diikuti dengan alkohol absolut. Mulai dari memasukkan ke dalam botol I alkohol 30%, lalu setelah 20 menit pindahkan potongan organ ke dalam botol II alkohol 30%, dan setelah 20 menit masukkan potongan dari botol II ke dalam botol III alkohol 30%. Dan setelah selesai di konsentrasi 30%, masukkan potongan organ jantung ke dalam larutan alkohol botol I 50% dan lakukan perendaman seperti sebelumnya secara berurutan. Lakukan perendaman berurutan dari larutan alkohol 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, dan alkohol absolut.
3.5.5.3. Clearing
Proses clearing dilakukan dengan tujuan memisahkan alkohol dari jaringan. Proses ini dilakukan dengan memasukkan jaringan yang telah di dehidrasi ke dalam campuran larutan alkohol 25 ml dan toluol 25 ml selama 25 menit dengan perbandingan 1:1. Setelah itu ambil jaringan dan keringkan dengan kertas saring, lalu diikuti dengan memasukkan ke dalam toluol murni 100 ml selama 60 menit atau hingga jaringan menjadi bening.
3.5.5.4. Embedding
Proses embedding dilakukan dengan tujuan untuk mengeluarkan cairan dari proses clearing. Tahapannya yaitu mengambil jaringan yang telah diproses di clearing, lalu masukkan ke dalam larutan campuran toluol-paraffin sebanyak 50
ml dan rendam organ dalam larutan tersebut di suhu ruangan, diamkan dalam 24 jam. Lalu, siapkan paraffin cair yang telah dipanaskan dalam suhu 60 derajat, bagi dalam paraffin I, II, III, dan IV. Pindahkan jaringan yang telah direndam ke dalam paraffin cair I selama 15 menit. Lakukan pengulangan pada paraffin II, III, dan IV.
3.5.5.5. Blocking
Proses blocking bertujuan untuk membuat blok jaringan dalam tissue
casset, agar jaringan dapat dipotong dengan mikrotom. Ambil cairan parafin yang
telah dibuat, lalu tuangkan ke dalam cetakan blok tissue casset yang dibawahnya dilapisi oleh kertas tebal yang berukuran sama dengan tiap tissue casset. Masukkan potongan organ yang telah di embedding ke dalam cetakan secara perlahan, lalu tuangkan parafin hingga organ terendam di dalam cetakan. Tulis masing-masing dengan kode tiap tikus. Biarkan cetakan membeku di suhu ruangan, lalu lepas blok paraffin dari cetakan dan simpan blok dalam suhu dingin (4C).
3.5.5.6. Pemotongan Blok Jaringan
Pemotongan jaringan dilakukan menggunakan mikrotom. Blok paraffin dipotong menggunakan mikrotom dengan ketebalan 6 m. Lalu masukkan potongan yang mengandung jaringan ke dalam waterbath yang bersuhu 46C secara hati-hati. Siapkan kaca objek, oleskan dengan albumin dan gliserin sebagai bahan perekat. Tempatkan potongan jaringan dari waterbath ke atas kaca objek dan letakkan di atlas slide dryer bersuhu 60C hingga preparat siap untuk diwarnai.
3.5.5.7. Pewarnaan dengan Hematoksilin-Eosin
Pewarnaan jaringan dilakukan untuk memberi warna pada irisan jaringan. Bahan yang digunakan adalah larutan hematoksilin dan larutan eosin. Larutan Hematoksilin dibuat dengan penimbangan 1 gram serbuk hematoksilin, potassium aluminium sulfat 50 gram, dan sodium iodate (NaIO3) 0,2 gram dilarutkan dalam satu liter akuades dengan magnetic stirrer dan diaduk. Diamkan satu malam di suhu ruangan. Lalu, tambahkan asam sitrat 50 gram dan chloral hydrate 50 gram, dan panaskan larutan diiringi diaduk selama lima menit, lalu dinginkan dan saring. Larutan Eosin dibuat dengan penimbangan serbuk eosin sebanyak 7,5
gram, erythrosin 7,5 gram, dan calcium klorida 2,5 gram. Lalu, larutkan dalam aquades satu liter dan disaring. Lalu buatlah xylol, alkohol konsentrasi 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, alkohol absolut, alkohol asam, hematoksilin, eosin, dan akuades dan semua larutan dimasukkan ke dalam staning jar. Lalu masukkan dan rendam kaca preparat yang berisi jaringan dengan urutan sebagai berikut:
Tabel 3.5.5.7 Proses Pewarnaan Preparat
Xylol 1 10 menit
Xylol 2 10 menit
Alkohol absolut 5 menit
Alkohol absolut 5 menit
Alkohol 95% 1 menit
Alkohol 90% 1 menit
Alkohol 80% 1 menit
Alkohol 70% 1 menit
Akuades 4 menit
Larutan hematoksilin 75 ml 3-5 menit
Akuades 1 menit
Akuades 1 menit
Akuades 1 menit
Alcohol acid 30 detik
Air mengalir 3-5 menit
Akuades 1 menit Eosin 1-2 menit Akuades 1 menit Akuades 1 menit Akuades 1 menit Alkohol 50% 1 menit Alkohol 70% 1 menit Alkohol 80% 1 menit Alkohol 90% 1 menit Alkohol 95% 1 menit
Alkohol absolut 1 menit
Xylol 3 menit
Xylol 3 menit
Xylol 3 menit
Kaca preparat diangkat dalam keadaan basah. Lalu, beri satu tetes canada balsam dan tutup setiap preparat dengan coverglass. Lihat hasil pewarnaan jaringan menggunakan mikroskop. (Lampiran 6).
3.5.5.8. Foto Preparat Jaringan
Foto jaringan menggunakan mikroskop kamera Olympus yang terdapat di laboratorium histologi Fakultas Kedokteran UIN. Langkah -langkah melakukan foto jaringan yaitu menyalakan stabilizer dan komputer, lalu masukkan flash disk program mikroskop. Ketika komputer menyala, klik program berjudul ―DP2-BSW‖ di desktop. Menyalakan mikroskop dan letakkan preparat yang akan di foto. Pada komputer, buatlah halaman baru, dan klik “Live”. Sesuaikan tuas di lensa okuler untuk memunculkan tampilan gambar yaitu: gambar tampak di lensa okuler mikroskop, gambar tampak di layar monitor komputer, dan gambar tampak di lensa okuler mikroskop dan layar monitor komputer. Jika ingin menampilkan gambar di lensa okuler mikroskop dan layar komputer, sesuaikan lensa objektif dan tayangan monitor dengan klik ikon di bagian atas yaitu: Lensa objektif cincin merah:PLN 4x/0,1; lensa objektif cincin kuning: PLN 10x/0,25; lensa objektif cincin hijau: PLN 20x/0,4; lensa objektif cincin biru: PLN 40x/0,65, lensa objektif cincin putih: PLN100x/1,25. Tentukan objek yang akan difoto, lalu klik “Snap” untuk mengambil gambar, dan simpan file dalam bentuk JPEG dan masukkan ke dalam folder. Jika telah selesai, cabut flash disk, dan matikan komputer, mikroskop, dan stabilizer.