BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.2 Amplifikasi Gen Penyandi Endo-1,4-β-xilanase dengan Metode
Amplifikasi gen dengan teknik PCR membutuhkan sepasang primer yang sesuai. Pada penelitian ini didesain sepasang primer forward(endo F) dan primer
reverse (endoR) dengan menggunakan software clone manager.Primer didesain berdasarkan pada urutan basa nukleotidagen penyandi endo-1,4-β-xilanase yang diambil dari Genbank.Urutan basa nukleotida gen penyandiendo-1,4-β-xilanase yang diambil berasal dari kelompok hidrolase famili 11 Bacillus subtillis
disebabkan karena bakteri xilanolitik dari sistem abdominal rayap isolat 7 telah diidentifikasi secara mikrobiologis memiliki homologi dengan Bacillus subtilis. Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isoalt 7 bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah didesain berdasarkan gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dari beberapa GH famili 11 yaituBacillus subtilisgalur BD403 endo1,4beta-xyl (DQ100306.1), Bacillus subtilisgalur G1
xylanase gene (EU848308.1), Bacillus subtilisgalur MW10 endo-1,4-beta-xyl
(DQ100307.1), dan Bacillus subtilisgalur R5 xyl (AB457186.1). Keempat jenis bakteri tersebut mengandung gen penyandi enzim endo-xilanase dengan ukuran rata-rata ± 600 bp dilakukan aligmentsehingga dihasilkan suatu daerah lestari seperti yang dapat dilihat pada Gambar 4.2
32
Gambar 4.2 Hasil aligmentBacillus subtilisgalur BD403 endo1,4beta-xyl
(DQ100306.1), Bacillus subtilisgalur G1 xylanase gene
(EU848308.1), Bacillus subtilisgalur MW10 endo-1,4-beta-xyl
(DQ100307.1), dan Bacillus subtilisgalur R5 xyl (AB457186.1) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
33
Sambrook and Russel(2001), menyebutkan beberapa hal yang perlu diperhatikan untuk mendesain primer yaitu panjang nukleotida antara 18-25, memiliki 40-60% basa GC, tidak terjadi hairpin maupun dimer serta pada ujung 3’ tidak boleh lebih dari 3 nukleotida dari primer forward komplemen dengan primer reverse ataupun sebaliknya. Pada penelitian ini diambil basa nukleotida dengan urutan tertentudan ditambah urutan sisi pengenal enzim restriksi yang terdapat pada multiple cloning side(MCS) pada vektor plasmid pYES2 sehingga dapat diinsersikan pada plasmid pYES2.Dari hasil analisis, urutan sisi pengenal enzim restriksi yang sesuai pada MCS pYES2dan tidak terdapat padahasil
aligmentdi atas adalah SacI dan XhoI. Maka selanjutnya primer forward didesain dengan penambahan sisi restriksi SacI (GAGCTC)dengan kodon start ATG pada ujung 5’ dan primer reverse dengan penambahan sisi restriksi XhoI (CTCGAG)pada ujung 3’ dengan stop kodon TAA.Untuk melengkapi %GC primer ditambahkan basa GC sebagai pijakan. Primer forward endoF didesain dengan panjang basa nukleotida sebesar 39bp dengan urutan basa 5’ GGGGAGCTCTCCATGTTAAGTTTAAAAAGAATTTCTTAGTT 3’. Primer
forward endoF memiliki Tm sebesar 67°C, 30% GC, tidak terjadi dimers dan harpains serta serta pada ujung 3’ tidak lebih dari 3 nukleotida dari primer
forward komplemen dengan primer reverse ataupun sebaliknya. Sedangkan primer reverse endoR memiliki 23 panjang basa nukleotida dengan urutan basa 5’
GCCTCGAGTTACCACACTGTTAC 3’. Primer reverse endoR memiliki Tm
sebesar 64°C, 52% GC, tidak terjadi dimers dan harpains serta serta pada ujung 3’ tidak lebih dari 3 nukleotida dari primer forward komplemen dengan primer
34
reverse ataupun sebaliknya. Gambar 4.3 dan 4.4 menunujukkan hasil analisis desain primer forward endoF dan reverseendoR.
Gambar 4.3 Analisis Primer Forward (endoF) ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
35
Gambar 4.4 Analisis Primer Reverse (endoR)
Analisis primer oleh program Clone manager pada Gambar 4.3 dan 4.5 menunjukkan primer reverse memenuhi kriteria primer PCR yang disarankan oleh program Clone manager. Sedangkan primer forwardmemiliki beberapa kriteria yang disarankan oleh program Clone manageryang tidak terpenuhi. Primer
forward memiliki panjang primer sepanjang 39 dan 30% GC. Dalam teorinya, jika suatu primer terlalu panjang maka dapat menyebabkan kegagalan replikasi (Irawan, 2008 ; Yuwono, 2006). Namun, dalam penelitian(Paice, et al., 1986) dan (Huang et al., 2005) pernah melakukan amplifikasi gen penyandi xilanase dengan panjang basa 39 basa nukleotida. Urutan primer forward yang digunakan yaitu 5’CGAATTCCATGTTTAAGTTTAAAAAGAATTTCTTAGTT 3’. Primer tersebut sama seperti primer forwardendoF yang digunakan pada penelitian ini dengan penambahan GC dan penambahan sisi restriksi yang berbeda. Primer
36
forward Primer forward endoF dan primer reverse endoR kemudian di-alignment
dengan gen endo-1,4-β-xilanase GH 11 dari Bacillus subtillis(Gambar 4.5).
Gambar 4.5 Hasil alignment gen endo-1,4-β-xilanase GH 11 dari Bacillus subtillis dengan primer forward endoF (F3 ENDO ORI) dan primer reverse endoR (R ENDO INVERS)
37
Reaksi PCR dilakukan dengan mencampurkan primer, DNA cetakan, MgSO4,enzim Taq DNA polimerase, dNTP serta larutan buffer. Enzim Taq DNA polimerase memiliki aktivitas untuk memperpanjang rantai DNA yang mampu mempertahankan aktivitasnya pada suhu tinggi (sampai 95°C) walaupun dilakukan pemanasan beberapa kali (Bintang, 2010). Ion Mg2+ dari MgSO4
berfungsi sebagai kofaktor bagi enzim Taq polimerase. PCR kemudian dijalankan dengan kondisi sebagai berikut : denaturasi awal 94C 1menit; annealing 58C selama 1menit; dan elongasi 72C selama 1 menit. Pada suhu 94C yaitu pada proses denaturasi, DNA untai ganda akan terbelah menjadi untai tunggal akibat pemanasan yang merusak ikatan hidrogen yang menghubungkan untai DNA. Suhu kemudian diturunkan pada proses annealing. Pada suhu ini primer akan melekat pada segmen yang komplemen pada DNA untai tunggal. Pada awal penelitian ini annealing dilakukan pada variasi suhu55˚C, 58˚C, 60˚C, 62˚C. Variasi suhu dilakukan adalah untuk mencari suhu optimum yang bisa mengamplifikasi DNA target dengan baik. Dari hasil variasi suhu tersebut, DNA penyandi endoxilanase dari sistem abdominal rayap tanah dapat diamplifikasi pada suhu annealing 58C. Amplikon PCR kemudian dianalisis menggunakan elektroforesis gel agarosa. Agarosa biasa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA dengan rentang ukuran beberapa ratus hingga sekitar 20.000 kb. DNA yang bermuatan negatif akan menuju ke kutub positif dengan adanya arus listrik yang diberikan. DNA dengan ukuran molekul lebih kecil akan lebih cepat bermigrasi melewati gel dibandingkan dengan DNA yang ukuran molekulnya lebih besar. Visualisasi pita DNA dalam gel agarosa ini dapat dilihat melalui UV
38
transluminator dimana sebelumnya dilakukan pewarnaan dengan Etidium Bromide (EtBr). Amplikon PCR yang berhasil diamplifikasi pada penelitian ini yaitu sebesar ±500 bp (Gambar 4.4)
Gambar 4.6. Hasil elektroforesis PCR menggunakan primer endoF dan endoR A. GeneRulerTM 1 kb DNA ladder
B. Amplikon gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat 7 bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah hasil PCR
Primer forward endoF dan reverse endoR didesain dengan primer forward
menempel dari sisi ujung dengan start kodon ATG dan primer reverse endoR menempel dari sisi ujung dengan stop kodon TAA. Kedua primer bergerak dari ujung ke ujung pada urutan template sepanjang ±600bp sehingga pada amplifikasi dengan primer endoF dan endoR ini dapat diperoleh PCR sebanyak sekitar 0,5bp. Sebelumnya telah didesain pula primer forward dan reversedengan urutan primer
forward 5’- GCGAGCTCATGGCAATGGATA -3’ dan primer reverse 5’-
GCCTCGAGTTACCACACTGTTAC -3’ kedua primer ini memenuhi kriteria 250bp 500bp 1000bp 1500bp 3000bp A B ± 0,5bp ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
39
analisis primer dari software Clone Manager (Gambar 4.6). Jika dilakukan homologi, primer forwardbergerak dari posisi tengah sedamgkan primer reverse
di sisi ujung (Gambar 4.7). Kedua primer ini berhasil mengamplifikasi fragmen DNA pada ±200bp (Gambar 4.8). Bila dibandinngkan desain primer 2 mengamplifikasi DNA dengan ukuran yang lebih sedikit dan fragmen yang dihasilkan lebih tipis. Oleh karena itu data yang digunakan adalah data hasil amplifikasi dari primer endoF dan endoR dengan ukuran ±0,5bp.
forward reverse
40
Gambar 4.7 Hasil aligment desain primer 2
Gambar 4.8 Desain Primer 2 ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga