BAB III METODE PENELITIAN
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1.1 Pembuatan LB Cair
Media LB cair dibuat dengan melarutkan yeast extract 0,5% (b/v), bacto trypton 1% (b/v), NaCl 1% (b/v) dalam akuades sampai 100 mL dalam Erlenmeyer. Bahan yang sudah dicampur kemudian disterilkan menggunakan autoklaf 121 oC selama 15 menit.
3.3.1.2 Pembuatan LB Padat
Media LB padat dibuat dengan melarutkan bacto-agar 2% (b/v), yeast extract 0,5% (b/v), bacto trypton 1% (b/v), NaCl 1% (b/v) ke dalam akuades sampai 100 mL dalam Enlemeyer. Campuran bahan kemudian disterilkan menggunakan autoklaf 121 oC selama 15 menit. Media yang masih hangat-hangat kuku kemudian dipindah ke dalam cawan petri steril hingga memadat.
24
3.3.2 Peremajaan Isolat 7 Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap Tanah
Bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah isolat 7 diremajakan dengan cara ditumbuhkan pada media LB padat. Koloni Bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah diambil dari biakan lama dengan menggunakan kawat ose. Kawat ose kemudian digoreskan pada media LB padat lalu diinkubasi pada suhu 37 ˚C selama ±18 jam. Pemindahan biakan bakteri pada media LB ini dilakukan pada laminar dengan proses yang steril.
3.3.3 Isolasi DNA Kromosom
Koloni bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah isolat 7 diinokulasikan ke dalam 100 ml LB cair dan diinkubasi pada shaker incubator
pada suhu 37 0C dengan kecepatan 150 rpm selama 18 jam. Suspensi sel kemudian disentrifugasi 6.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4˚C. Pellet sel disuspensikan dengan 5 ml buffer TE (Tris HCL EDTA) yang merupakan campuran tris HCl pH 8 50 mM dan EDTA 50 mM. Pellet yang diperoleh dibekukan pada suhu -20˚C selama ±30 menit. Setelah itu ditambahkan larutan lisozim 10 mg/ml sebanyak 500 μL ke dalam sel beku dan kemudian dicairkan pada suhu kamar (23˚C). Larutan yang sudah mencair dipindahkan ke dalam penangas es selama 45 menit. Suspensi sel ditambahkan larutan STEP fresh (SDS 1%, Tris Cl, EDTA pH 8, Proteinase K) sebanyak 1 ml dan dicampur dengan baik. Campuran dipanaskan dalam waterbath 50˚C selama 1 jam sambil digoyang perlahan. Suspensi sel kemudian ditambahkan 6 ml fenol jenuh dalam buffer tris kemudian campur perlahan selama 5 menit hingga terbentuk emulsi. Campuran
25
disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit. Fasa paling atas dipindahkan pada tabung eppendorf baru yang steril. Selanjutnya ditambahkan larutan Natrium Asetat 0,3 M sebanyak 0,1 kali dari volume total, lalu dicampur perlahan. Kemudian ditambahkan etanol absolut dingin sebanyak 2 kali volume larutan kemudian tabung dibolak-balik agar tercampur dengan baik. Setelah itu, campuran diinkubasi pada suhu -20oC semalam. Campuran disentifugasi pada 12000 rpm selama 5 menit, kemudian supernatan dibuang dan pellet dicuci dengan 0,6 ml etanol 70%. Campuran disentrifugasi kembali pada 12000 rpm selama 10 menit. Pelet diambil kemudian dilarutkan ke dalam ddH2O. Kadar larutan DNA dapat diukur dengan Spektrofotometer nano-drop pada panjang gelombang A260/A280 nm.
3.3.4 Analisis DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa
Gel agarosa dibuat dengan melarutkan 0,4 gr agarosa dalam 40 ml buffer TAE, kemudian dididihkan. Setelah larut sempurna, larutan gel dicetak pada wadah elektroforesis yang telah diberi pencetak sumur, kemudian ditunggu sampai mengeras. Analisis DNA menggunakan elektroforesis gel agarosa dilakukan dengan mengambil buffer loading sebanyak 3 µL, lalu menghomogenkannya dengan 4 µL DNA yang akan dielektroforesis. Sebelumnya telah dilakukan persiapan pada perangkat elektroforesis yaitu dengan menambahkan buffer TAE pada wadah elektroforesis sampai gel agarosa benar-benar tercelup. Campuran DNA dan buffer loading yang telah homogen kemudian dimasukkan dalam sumur pada gel agarosa. Gel agarosa yang sudah
26
dielektroforesis dicelupkan dalam larutan EtBr untuk pewarnaan. Pita DNA dapat dilihat di atas UV transluminator.
3.3.5 Amplifikasi Gen Penyandi Endo-1,4-β-xilanase dengan Metode PCR Untuk melakukan PCR dibutuhkan sepasang oligonukleotida primer. Primer didesain dengan menggunakan program computer yang bernama clone manager. Untuk mendesain primer dibutuhkan urutan basa nukleotida penyandi gen endo-1,4-β-xilanase yang didapat dari Genbank, www.ncbi.nlm.nih.gov. Setelah didapatkan urutan gen penyandi endo-1,4-β-xilanase kemudian dicari homologinya. Daerah yang konserv diambil bagian ujung depan sebagai primer
forward ujung belakang sebagai primer reverse.
Komposisi PCR terdiri DNA kromosom 10 μl, primer forward 2 μl, primer
reverse 2 μl, MgSO4 1 μl, Taq polimerase 2 μl, buffer Taq 2 μl dan dNTP 1 μl sehingga menghasilkan komposisi campuran total sebanyak 20 μl. Proses amplifikasi gen endo-1,4-β-xilanase dari bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah isolat 7 dilakukan pada kondisi PCR sebagai berikut: denaturasi pada suhu 94 oC selama1 menit, annealing pada variasi suhu 52 oC; 55 oC; 58 oC; 62 oC dan 64 oC selama 1 menit dan elongasi pada suhu 72 oC selama 1 menit dengan jumlah siklus 30 kali. Proses amplifikasi diawali dengan pra-denaturasi pada suhu 94 oC selama 5 menit dan diakhiri dengan pasca elongasi yang dilakukan pada suhu 72 oC selama 10 menit. Produk PCR kemudian dianalisis menggunakan elektroforesis gel agarosa.
27
3.3.6 Purifikasi Produk PCR
Produk PCR yang dihasilkan dielektroforesis menggunakan gel agarosa 1% (0.6 gr agarosa dalam 60 mL buffer TAE). Elektroforesis dilakukan dengan mencampur produk PCR dengan buffer loading dan dilakukan pada 50V selama ±1 jam. Gel yang mengandung pita DNA kemudian dipotong dengan cutter steril dan dimasukkan ke dalam tabung eppendrof untuk dilakukan purifikasi dengan menggunakan QI Aquick Gel Extraction KIT 50. Gel yang berada dalam tabung eppendorf ditambahkan dengan larutan capture buffer (asam asetat dan chaotropic agent) dengan perbandingan berat gel : buffer adalah 0.3 gram : 0,9 ml. campuran diinkubasi pada 50˚C selama 10 menit. Tiap 5 menit dikocok agar gel tercampur rata dengan buffer. Setelah itu larutan dimasukkan ke dalam tabung KIT dengan menggunakan mikro pipet. Campuran disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 2 menit. Supernatan dibuang dan residu yang tertinggal dalam kolom ditambahkan dengan buffer washing (buffer Tris HCl pH 8, EDTA 1 mM dan etanol absolut). Kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 15 menit. Campuran disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12.000 rpm selama 2 menit. Residu yang tertinggal dalam kolom dielusi menggunakan 25 μl ddH2O steril dan ditampung dalam tabung eppendorf steril. Larutan diinkubasi pada suhu kamar selama 1-5 menit dan disentrifugasi kembali 12.000 rpm selama 2 menit. Produk purfikasi yang dihasilkan disimpan dalam -20˚C.
3.3.7 Sekuensing Amplikon dengan Metode Sanger
Sekuensing dilakukan dengan alat Applied Biosystem 3730XL di Laboratorium Macrogen Singapore.
28