BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.7 Analisis Protein
2.7.2 Analisa Kuantitatif
Metode ini merupakan metode yang sederhana untuk penetapan nitrogen total pada asam amino, protein, dan senyawa yang mengandung nitrogen. Sampel didestruksi dengan asam sulfat dan dikatalisis dengan katalisator yang sesuai sehingga akan menghasilkan amonium sulfat. Setelah pembebasan alkali dengan kuat, amonia yang terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke dalam larutan penyerap dan ditetapkan secara titrasi (Hasan, 2010).
b. Metode Titrasi Formol
Larutan protein dinetralkan dengan basa (NaOH) lalu ditambahkan formalin akan membentuk dimethilol. Dengan terbentuknya dimethilol ini berarti gugus aminonya sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi reaksi antara asam dengan basa NaOH sehingga akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah p.p., akhir titrasi bila tepat terjadi perubahan warna menjadi merah muda yang tidak hilang dalam 30 detik (Hasan, 2010).
c. Metode Lowry
Reaksi antara Cu2+ dengan ikatan peptida dan reduksi asam fosfomolibdat dan asam fosfotungstat oleh tirosin dan triptofan ( merupakan residu protein) akan menghasilkan warna biru. Warna yang terbentuk terutama dari hasil reduksi fosfomolibdat dan fosfotungstat, oleh karena itu warna yang terbentuk tergantung pada kadar tirosin dan triptofan dalam protein. Metode lowry memiliki keuntungan
karena 100 kali lebih sensitif dari metode biuret. Senyawa fenol juga dapat mengganggu hasil penetapan. Gangguan ini dapat dihilangkan dengan cara mengendapkan potein dengan TCA, hilangkan supernatannya lalu melarutkannya kembali endapan protein yang diendapkan oleh TCA tadi, kemudian dianalisis selanjutnya (Hasan, 2010).
d. Metode Spektrofotometri UV
Asam amino penyusun protein diantaranya adalah triptofan, tirosin dan fenilalanin yang mempunyai gugus aromatik. Triptofan mempunyai absorbsi maksimum pada 280 nm, sedang untuk tirosin mempunyai absorbsi maksimum pada 278 nm. Fenilalanin menyerap sinar kurang kuat dan pada panjang gelombang lebih pendek. Absorpsi sinar pada 280 nm dapat digunakan untuk estimasi konsentrasi protein dalam larutan. Supaya hasilnya lebih teliti perlu dikoreksi kemungkinan adanya asam nukleat dengan pengukuran absorpsi pada 260 nm.
Pengukuran pada 260 nm untuk melihat kemungkinan kontaminasi oleh asam nukleat. Rasio absorpsi 280/260 menentukan faktor koreksi yang ada dalam suatu tabel (Hasan, 2010).
e. Metode Spektrofotometri Visible (Biuret)
Semua protein terususun dari asam-asam amino yang terhubung oleh ikatan- ikatan peptida. Ion Cu2+ dari CuSO4 dalam suasana basa NaOH akan membentuk kompleks dengan ikatan peptida protein (-CO-NH-), kompleks ini memberikan akan warna sehingga konsentrasi protein dapat ditentukan dengan spektrofotometer sinar tampak. Pengukuran serapan dapat dilakukan pada panjang gelombang daerah sinar tampak panjang gelombang 380 nm-780 nm (Yusdiana, 2018).
BAB III
METODE PENELITIAN 3.1 Tempat dan Waktu Percobaan
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Penelitian Universitas Sumatera Utara mulai bulan Mei sampai Juni 2021.
3.2 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan adalah blender, corong kaca, erlenmeyer Iwaki Pyrex (500 ml), gelas kimia Pyrex (25 ml, 50 ml, 250 ml, 500 ml), gelas ukur Pyrex (5 ml, 10 ml, 500 ml), kaca arloji, kertas saring, labu tentukur Iwaki Pyrex (5 ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml), pH meter Hanna, pipet tetes, sentrifuse Hitachi, Sonikator Branson, spatula, spektrofotometer UV-Vis Shimadzu 1800, tabung sentrifugasi 50 ml, timbangan analitik Sartorius, dan vortex Boeco
3.3 Pereaksi
Bahan-bahan yang digunakan adalah air suling, ammonium sulfat, asam asetat, Bovine Serum Albumin (BSA), tembaga (II) sulfat, kalium natrium tartrat, natrium asetat dan natrium hidroksida.
3.4 Pembuatan Pereaksi
Pembuatan Pereaksi Natrium Hidroksida (NaOH) 10%: dilarutkan 10 gram NaOH ke dalam 30 ml air suling, setelah larut dan dingin dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, diencerkan sampai garis tanda pada labu tentukur.
Pembuatan pereaksi Biuret: dilarutkan 0,15 gram tembaga (II) sulfat dan 0,6 gram kalium natrium tartrat dalam 50 ml air suling dalam labu tentukur 100 ml.
Kemudian ditambahkan 30 ml natrium hidroksida 10% sambil dihomogenkan, selanjutnya ditambahkan air suling sampai garis tanda.
Pembuatan Larutan Buffer Asam Asetat pH 5: campuran dari 2,8 ml asam asetat 0,2 M dengan 5 ml natrium asetat 0,2 M maka terlebih dahulu dibuat : a. Larutan asam asetat 0,2 M
Diencerkan 1,2 ml asam asetat glasial 100% dengan akuades sampai 100 ml.
b. Larutan natrium asetat 0,2 M
Dilarutan 1,64 gram natrium asetat dengan akuades sampai 100 ml. Setelah itu dicampurkan kedua larutan dalam labu tentukur 100 ml, kemudian ditambahkan akuades sampai garis tanda dan kocok. Diukur pH larutan yang dikehendaki yaitu 5.
3.5 Sampel
Pengambilan sampel dilakukan secara purposif, artinya sampel dipilih hanya atas dasar pertimbangan peneliti dengan anggapan bahwa unsur-unsur yang ingin diteliti sudah mewakili seluruh anggota sampel. Sampel yang digunakan adalah susu kedelai yang masing-masing dijual dari Pajak Sore Padang Bulan Medan.
3.6 Penentuan Kadar Protein dengan Metode Spektrofotometri UV-Vis 3.6.1 Panjang Gelombang Serapan Maksimum BSA
Pembuatan Larutan Induk Baku Bovine Serum Albumin (BSA) 22.000 ppm dilakukan dengan menimbang 1,1 gram Bovine Serum Albumin (BSA), kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml sampai garis tanda.
Setelah itu, dilanjutkan dengan mengencerkan larutan menjadi 1.100 ppm dengan cara mengambil sebanyak 0,25 ml larutan BSA dan dimasukkan ke dalam labu tentukur 5 ml kemudian ditambahkan 0,4 ml pereaksi Biuret, selanjutnya ditambahkan akuades sampai garis tanda. Setelah itu larutan didiamkan selama ±
25 menit, diukur serapan pada panjang gelombang 400-800 nm. Catat panjang gelombang serapan maksimum yang diperoleh tersebut (Jubaidah, 2016).
3.6.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi Bovine Serum Albumin (BSA)
Disiapkan enam labu tentukur 5 ml. Dipipet 0,15 ml; 0,3 ml; 0,4 ml; 0,45 ml dan 0,55 ml larutan BSA induk 22.000 ppm dan dimasukkan ke setiap labu tentukur 5 ml. Kemudian ditambahkan pereaksi Biuret masing-masing 0,4 ml dan dicukupkan dengan akuades sampai garis tanda sehingga diperoleh konsentrasi berutur-turut 660 ppm, 1.320 ppm, 1.760 ppm, 1.80 ppm dan 2.420 ppm. Kemudian diinkubasi selama 25 menit, kemudian diukur absorbansi masing-masing larutan dengan Spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimum yang telah diperoleh sebelumnya (Jubaidah, 2016).
3.6.3 Pengukuran Kadar Protein Susu Kedelai
Dipipet sampel susu kedelai sebanyak 5 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian diendapkan dahulu dengan penambahan amonium sulfat kristal sambil dihomogenkan dengan vortex sampai jenuh. Kemudian dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi disentrifugasi dengan kecepatan 11.000 rpm selama 10 menit, kemudian dipisahkan supernatannya. Diambil lapisan yang atas, dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 ml, dilarutkan dengan buffer Asetat pH 5.
Kemudian dipipet 0,1 ml larutan yang terbentuk dan dimasukkan ke dalam labu tentukur 5 ml, kemudian ditambahkan 0,4 ml reagen Biuret, lalu selanjutnya ditambah dengan larutan buffer Asam Asetat pH 5 sampai batas tanda. Setelah itu larutan didiamkan selama ± 25 menit pada suhu ruang. Dibaca absorbansi pada Spektrofotometer UV-Vis dengan panjang gelombang maksimum yang telah diperoleh. Dilakukan pengulangan 3 kali.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Panjang Gelombang Serapan Maksimum Bovine Serum Albumin (BSA)
Penentuan panjang gelombang serapan maksimum Bovine Serum Albumin (BSA) pada konsentrasi 1.100 ppm dalam labu tentukur 5 ml dilakukan pada menit ke-25 setelah penambahan 0,4 ml pereaksi Biuret, serta ditambahkan akuades sampai garis tanda, dan diukur pada panjang gelombang 400-800 nm (Serlahwaty, 2015). Hasil pengukuran panjang gelombang serapan maksimum Bovine Serum Albumin (BSA) dapat dilihat pada Gambar 4.1.
Gambar 4.1 Kurva panjang gelombang serapan maksimum BSA (545 nm)
Berdasarkan Gambar 4.1, panjang gelombang serapan maksimum BSA diperoleh pada 545 nm. Menurut Lubran (1978), panjang gelombang serapan maksimum BSA dapat diperoleh diantara wilayah 540 sampai 570 nm.
Penambahan pereaksi Biuret akan menghasilkan perubahan warna menjadi ungu untuk menunjukkan hasil yang positif sehingga konsentrasi protein pada susu kedelai dapat ditentukan dengan Spektrofotometer sinar tampak. Perubahan warna ini terjadi karena adanya reaksi Biuret dengan ikatan peptida dari protein susu kedelai. Ion Cu2+ dari CuSo4 dalam suasana basa NaOH akan membentuk kompleks dengan ikatan peptida protein pada susu kedelai, kompleks ini yang menyebabkan perubahan warna (Yusdiana, 2018).
4.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi Bovine Serum Albumin (BSA)
Pembuatan kurva kalibrasi Bovine Serum Albumin (BSA) dilakukan dengan mengukur absorbansi Bovine Serum Albumin (BSA) pada konsentrasi 0 ppm, 660 ppm, 1.320 ppm, 1.760 ppm, 1.980 ppm dan 2.420 ppm, pada panjang gelombang 545 nm. Nilai absorbansi Bovine Serum Albumin (BSA) dengan berbagai konsentrasi dapat dilihat pada Tabel 4.2 dan kurva kalibrasi Bovine Serum Albumin (BSA) dengan berbagai konsentrasi ditunjukkan oleh Gambar 4.2.
Tabel 4.2 Nilai absorbansi Bovine Serum Albumin (BSA) dengan berbagai
Gambar 4.2 Kurva Kalibrasi Bovine Serum Albumin (BSA) Berdasarkan hasil pembuatan kurva kalibrasi Bovine Serum Albumin (BSA) yang menghubungkan berbagai konsentrasi dengan absorbansi, diperoleh persamaan linear Y = 0,000324447X - 0,009665996, dimana nilai koefisien korelasi r = 0,998774285. Koefisien korelasi ini telah memenuhi kriteria penerimaan yaitu ≥ 0,98 (Wardani, 2017).
Koefisien korelasi atau uji kelinearan digunakan untuk mengetahui keabsahan dari kurva kalibrasi yang diperoleh. Semakin dekat nilai koefisien korelasi ke 1, maka semakin kuat korelasi positifnya. Jika koefisien korelasi bernilai 1 maka variabel menunjukkan korelasi positif sempurna (Hasan, 2006).
4.3 Pengukuran Kadar Protein pada Susu Kedelai
Hasil pengukuran sampel susu kedelai A dan susu kedelai B untuk penentuan kadar protein dengan menggunakan Spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 545 nm, dapat dilihat pada Tabel 4.3 dan untuk perhitungan dapat dilihat pada Lampiran 6.
0,9
y = 0,000324447x - 0,009665996 R = 0,998774285
Tabel 4.3 Hasil penetapan kadar protein susu kedelai
Sampel Konsentrasi Rata- Kadar Protein
rata (µg/ml) (%b/b)
Susu Kedelai A 893,8265 8,9382
Susu Kedelai B 2121,5565 21,2155
Dari Tabel 4.3 di atas, kadar protein dari setiap sampel memiliki hasil yang berbeda, kadar protein pada susu kedelai A diperoleh 8,9382% dan pada susu kedelai B diperoleh 21,2155%. Menurut Standar Nasional Indonesia (SNI) 01- 3830-1995 syarat minimum kadar protein pada susu kedelai 2,0%, maka disimpulkan susu kedelai A dan susu kedelai B memenuhi syarat minimum kadar protein.
Perbedaan kadar protein pada susu kedelai dapat disebabkan oleh beberapa faktor. Salah satunya suhu air pada proses penggilingan kedelai. Menurut penelitian Prasetyo (2004) penurunan kadar protein terjadi karena adanya denaturasi protein pada suhu yang tinggi. Menurut penelitian Malina (2011), suhu optimum untuk proses penggilingan kedelai adalah 60OC. Selain itu, penurunan kadar protein kedelai juga dapat disebabkan karena kualitas biji kedelai yang sudah rusak akibat panas atau mutunya memang rendah (Ginting, 2019).
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa :
a. Kadar protein dari susu kedelai A sebesar 8,9382% dan susu kedelai B sebesar 21,2155% yang ditentukan dengan metode Spektrofotometri UV- Vis.
b. Kadar protein pada susu kedelai A dan susu kedelai B yang ditentukan dengan metode Spektrofotometri UV-Vis memenuhi syarat SNI 01-3830- 1995 yang menyatakan syarat minimum kadar protein susu kedelai minimal 2,0%.
5.2 Saran
Berdasarkan penelitian yang dilakukan, maka penulis menyarankan untuk menguji kadar protein susu kedelai yang bermerek.
DAFTAR PUSTAKA
Alwi, H. (2017). Validasi Metode Analisis Flavonoid dari Ekstrak Etanol Kasumba Turate (Carthamus tinctorius L.) Secara Spektrofotometri Uv-Vis. Skripsi.
Makassar: Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Alauddin Makassar. Halaman 32-33.
Ekafitri, R. Dan Isworo, R. (2014). Pemanfaatan Kacang-Kacangan sebagai Bahan Baku Sumber Protein untuk Pangan Darurat. Jurnal Pangan. Surakarta:
Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret. Vol. 23(2): 134-135.
Erna, S. (2019). Uji Organoleptik dan Kadar Protein Terhadap Susu Nabati
Berbahan Baku Kacang Tanah (Arachis hypogaea) dengan Penambahan Perisa Jeruk Manis (Citrus sinensis). Skripsi. Yogyakarta: Fakultas
Keguruan dan Ilmu Pendidikan. Halaman 7-8.
Ginting, E. Dan Tastra, I. K. (2019). Standar Mutu Biji Kedelai. Kedelai: Teknik Produksi dan Pengembangan. Malang: Balai Penelitian Tanaman Kacang- kacangan dan Umbi-umbian: 456.
Hasan, I. (2006). Analisis Data Penelitian dengan Statistik. Jakarta: Bumi Aksara.
Halaman 43-44.
Hasan, K. (2010). Penetapan Kadar Protein Dengan Metode Spektrofotometri dan Kadar Lemak dengan Metode Sokletasi pada Terung Kopek Ungu dan Terung Kopek Hijau. Skripsi. Makassar: Fakultas Sains dan Teknologi UIN Alauddin Makassar. Halaman 33-37, 75-77.
Helwandi, I., R. (2016). Validasi Metode Spektrofotometri UV-Vis Analisis Tiga Panjang Gelombang untuk Penetapan Kadar Tablet Prednison yang
Mengandung Zat Pewarna. Skripsi. Surabaya: Fakultas Farmasi Universitas Airlangga. Halaman 16, 21-24.
Istiqomah (2014). Karakterisasi Mutu Susu Kedelai Baluran. Skripsi. Jember:
Fakultas Teknologi Pertanian. Halaman 4, 8.
Lubran, M. (1978). The Measurement of Total Serum Proteins by the Biuret Method. Annals Of Clinical and Laboratory Science. Vol 8(2): 107.
Maslinda (2011). Pengaruh Suhu Air pada Proses Penggilingan Kedelai (Glycine Max (L) Merril) Terhadap Kadar Protein Susu Dengan Metode Spektrofotometri Uv-Vis. Skripsi. Pekanbaru: Fakultas Tarbiyah dan Keguruan Universitas Islam Negeri Sultan Syarif Kasim Riau. Halaman 15- 16, 20-23, 52.
Pamungkasari, D. (2008). Kajian Penggunaan Susu Kedelai Sebagai Substitusi
Susu Sapi Terhadap Sifat Es Krim Ubi Jalar (Ipomoea batatas). Skripsi.
Surakarta: Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret. Halaman 14-15, 29-30.
Prasetyo, S. (2004). Peningkatan Mutu Susu Kedelai dengan Perlakuan pada Proses Penggilingan dan Penambahan Natrium Bikarbonat. Skripsi. Bandung:
Fakultas Teknologi Industri Universitas Katolik Parahyangan. Halaman 7- 8.
Purwanto, M., G., M. (2014). Perbandingan Analisa Kadar Protein Terlarut dengan Berbagai Metode Spektroskopi UV-Visible. Jurnal Ilmiah Sains &
Teknologi. Surabaya: Fakultas Teknobiologi Universitas Surabaya. Vol.
7(2): 69.
Rohmah, S., A., Muadifah, A. dan Martha R., D. (2021). Validasi Metode
Penetapan Kadar Pengawet Natrium Benzoat pada Sari Kedelai di Beberapa Kecamatan di Kabupaten Tulungagung Menggunakan Spektrofotometer Uv-Vis. Jurnal Sains dan Kesehatan. Tulungagung: Fakultas Farmasi STIKes Karya Putra Bangsa. Vol. 3(2): 121.
Serlahwaty, D., Syarmalina. dan Sari, N. (2015.) Analisis Kandungan Lemak dan Protein Terhadap Kualitas Soyghourt dengan Penambahan Susu Skim.
Berkala Ilmiah Kimia Farmasi. Jakarta: Fakultas Farmasi Universitas Pancasila. Vol 4 (2): 40.
SNI (1995). Susu Kedelai. SNI 01-3830-1995. Jakarta: Badan Standarisasi Nasional. Halaman 1.
Stefia, E., M. (2017). Analisis Morfologi dan Struktur Anatomi Tanaman Kedelai (Glycine max L.) pada Kondisi Tergenang. Tugas Akhir. Surabaya: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Teknologi Sepuluh November. Halaman 5, 14.
Wardani, N., T., K. (2017). Pengaruh Co(II) Pada Analisis Besi(III) dengan Pengompleks 1,10-Fenantrolin Pada PH 3,5 Secara Spektrofotometri UV- Vis. Skripsi. Surabaya: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Teknologi Sepuluh November. Halaman 16.
Warisno dan Dahana, K. (2010). Meraup Untung dari Olahan Kedelai. Cetakan Pertama. Jakarta: PT AgroMedia Pustaka. Halaman 4-6.
Yusdiana, N. (2018). Analisis Kadar Protein pada Okra (Abelmoschus Esculentus (L.) Moench) dengan Metode Kjeldahl. Skripsi. Medan: Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara. Halaman 19-20.
LAMPIRAN Lampiran 1. Gambar Sampel
Susu kedelai A (1) dan susu kedelai B (2)
Lampiran 2. Gambar Alat
Sonikator (Branson) pH Meter (Hanna)
Vortex (Boeco) Sentrifugasi (Hitachi)
Spektrofotometri UV-Vis (Shimadzu 1800) dan seperangkat PC dengan software UV Probe
Lampiran 3. Dokumentasi Penelitian
Sampel Sampel di sentrifugasi selama
10 menit dengan kecepatan 11.000 rpm
Penambahan buffer asetat pH 5 Perubahan warna setelah
pada endapan penambahan pereaksi biuret
Lampiran 4. Perhitungan Persamaan Regresi dan Kurva Kalibrasi Bovine
b = 0,4305 – (0,000324447)(1356,666666667) b = - 0,009665996
Jadi, persamaan regresi adalah Y = 0,000324447 X - 0,009665996 Koefisien korelasi (r)
r2 = (∑𝐗𝐘)−(∑𝐗)(∑𝐘)/𝐧
√[(∑𝑿𝟐)−(∑𝐗)𝟐/𝒏)] [(∑𝒀𝟐)−(∑𝐘)𝟐/𝒏]
r2 = (4805,02)−[(8140)(2,583)/6]
√[(15052400)−(8140)2/6)][(1,536081)−(2,583)2/6)]
r2 = 1300,75 1300,94457
= 0,997550072 r = 0,998774285
Lampiran 5. Contoh Perhitungan Kadar Protein Susu Kedelai PERHITUNGAN KADAR PROTEIN SUSU KEDELAI
Tabel Data Kadar Protein Susu Kedelai Susu
Kedelai Absorbansi Konsentrasi Kadar Protein Rata-rata Kadar
(µg/ml) (%b/b) Protein (%b/b)
A
0,273 871,223947208635 8,71223947208635
8,9382 0,286 911,2921247538119 9,112921247538119
0,282 898,9634547399113 8,989634547399113 B
0,681 2128,748288626494 21,28748288626494
21,2155 0,678 2119,501786116068 21,19501786116068
0,677 2116,419618612593 21,16419618612593 Perhitungan kadar protein :
Persamaan regresi yang diperoleh Y = 0,000324447 X - 0,009665996
FP = 5 0,1 FP = 50 kali
Y = 0,000324447 X - 0,009665996 O,273 = 0,000324447 X - 0,009665996
0,273 µ𝑔/𝑚𝑙 + 0,009665996
X =
0,000324447
X = 871,223947208635 µg/ml
X = 0,000871223947208635 gram/ml
% Protein = 𝑋
𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 (𝑚𝑙)
×
Volume Labu Awal×
FP×
100%% Protein = 0,000871223947208635 mg/ml
5 𝑚𝑙
×
10 ml×
50×
100%% Protein = 8,71223947208635 %
Dengan cara yang sama, maka dapat dicari kadar protein untuk masing- masing sampel.