Metode FTC-TBA mengacu pada Aqil, et al (2006). Fraksi dan standar BHT sebanyak 4 mg, dilarutkan dalam 4 ml etanol absolut dan ditambahkan 4,1 ml asam linoleat 2,5%, 8,0 ml buffer fosfat 0,05 M (pH 7), dan 3,9 mL akuades. Kemudian diinkubasi dalam oven pada suhu 400C (Larutan A). Kemudian, diambil 0,1 ml larutan ke dalam larutan yang telah berisi 9,7 mL etanol 75% dan 0,1 mL ammonium tiosianat 30% (Larutan B). Selanjutnya, ditambahkan 0,1 mL ferrous choride 0,05 M dalam 3,5% HCl. Sesuai hasil optimasi, didiamkan selama 5 menit dan absorbansi warna merah diukur pada = 488,5 nm. Pengukuran dilakukan setiap 24 jam sampai 1 hari setelah absorbansi kontrol negatif maksimum. Larutan tanpa sampel sebagai kontrol negatif.
Selanjutnya, larutan A sampel pada hari pengukuran terakhir diambil sebanyak 1 mL dan ditambahkan 2 mL asam trikloroasetat 20% dan 2 mL asam 2-tiobarbiturat 0,67%. Campuran tersebut dipanaskan dalam waterbath pada suhu 950C selama 10 menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 30 menit. Absorbansi supernatant tersebut diukur pada = 532 nm. Rumus perhitungan persen inhibisi :
%Inhibisi = (A0– A1/A0)x 100% Keterangan
A0 = absorbansi maksimum kontrol negatif; A1 = absorbansi maksimum sampel.
Dari nilai rata-rata persen inhibisi ± SD dilakukan uji distribusi menggunakan metode Kolmogorov-Smirnov. Dilakukan analisis one sampel T-test dan Independent Sampel T-T-test untuk data terdistribusi normal, dengan taraf kepercayaan 95% untuk melihat perbedaan secara statistik.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Estimasi kandungan fenolik total tumbuhan dapat dilakukan dengan mengunakan pereaksi Folin-Ciocalteu. Penetapan kandungan fenolik total dimulai dengan membuat kurva baku asam galat. Asam galat digunakan sebagai standar
kurva baku karena asam galat merupakan turunan dari asam hidrobenzoat yang tergolong asam fenol sederhana. Kandungan fenol asam organik ini juga bersifat murni dan stabil (Lee, et al., 2003). Pembuatan kurva baku asam galat dilakukan sebanyak tiga replikasi dan untuk menentukan kandungan fenolik total digunakan persamaan dengan nilai r terbaik. Nilai r menunjukkan nilai linearitas yaitu korelasi antara konsentrasi dan absorbansi yang dihasilkan. Semakin baik nilai linearitas (nilai r = 1 atau mendekati 1) maka korelasi juga semakin baik.
Berdasarkan ketiga persamaan regresi yang telah didapat (Lampiran 10.), dipilih persamaan dengan nilai r mendekati 1 yaitu persamaan replikasi III, y = 0,00662x + 0,0974 dengan nilai r sebesar 0,9924. Koefisien korelasi yang baik dilihat dari kesebandingan antara penambahan konsentrasi asam galat dan penambahan absorbansi. Berdasarkan perhitungan menggunakan persamaan regresi linear , y = 0,00662x + 0,0974, maka didapatkan kandungan fenolik total fraksi etil asetat daun Cabe Jawa sebesar 140,43 ± 5,1219 mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat ( mg GAE/g FEA cabe jawa, lihat Tabel I.).
Tabel I. Hasil Penetapan Kandungan Fenolik Total FEA Cabe Jawa
Konsentrasi Absorbansi Kandungan
Fenolik Total Rata-rata %CV Replikasi 1 200 μg/ml 0,274 133,40
140,43 ±
5,1219 3,6472%
Replikasi 2 200 μg/ml 0,286 142,45
Replikasi 3 200 μg/ml 0,290 145,45
Adapun prinsip dasar kolorimetri Folin Ciocalteu adalah reaksi oksidasi yang cepat dengan menggunakan alkali seperti natrium karbonat, dimana absorbansi yang terbentuk akibat fosfotungstat biru sebanding dengan jumlah senyawa fenolik yang terdapat dalam sampel (Cicco dan Latanzio, 2011 ; Cindric et al., 2011). Reaksi yang terjadi sebagai berikut:
Gambar 1. Reaksi Reagen Folin-Ciocalteu dengan Senyawa Fenol (Sumber: Hardiana et al, 2012)
Tanaman cabe jawa diketahui mengandung senyawa fenolik seperti senyawa piplartine/piperlongumine, sitosterol, 3,4,5-Trimehoxydihydrocinnamic acid dan lignin (Parmar, et al., 1997; Prasad, et al., 2012). Senyawa-senyawa inilah yang diduga bertanggung jawab dalam pembentukan kompleks warna fosfongtungstat biru dan penetapan kandungan fenolik total yang didapat.
Uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC dan TBA merupakan metode pengukuran aktivitas antioksidan berdasarkan kemampuannya dalam menghambat reaksi peroksidasi lipid. Dimana metode FTC untuk mengukur jumlah peroksida pada tahap awal peroksidasi lipid, kemudian dilanjutkan dengan penggunaan metode TBA untuk mengukur jumlah peroksida pada tahap kedua peroksidasi lipid dan mengukur radikal bebas yang ada setelah oksidasi peroksida (Aqil, et al., 2006; Rezaeizadeh, et al., 2011).
Pada metode FTC, peroksida yang terbentuk selama oksidasi asam linoleat akan bereaksi dengan Fe2+ untuk membentuk Fe3+, yang kemudian akan bereaksi dengan thiocyanate untuk membentuk kompleks warna merah. Keberadaan senyawa antioksidan akan memperlambat oksidasi asam linoleat, lihat gambar 2. (Ono et al. dan Gulcin & Dastan dalam Charles, 2013).
Gambar 2. Reaksi Pembentukan Kompleks Fe3+-tiosianat dari Kompleks Fe2+-tiosianat oleh hidroperoksida (Sumber: Moon dan Shibamoto, 2009)
Gambar 3. Profil kenaikan absorbansi metode FTC dalam waktu 7 hari
Pembacaan terjadinya proses peroksidasi lipid dapat dilakukan sampai kontrol negatif menunjukkan nilai absorbansi maksimum dan pada penelitian ini, absorbansi maksimum kontrol negatif diperoleh pada hari keenam, seperti yang tergambar dalam profil absorbansi (gambar 3). Nilai absorbansi menunjukkan jumlah radikal peroksida yang terbentuk selama proses oksidasi. Antioksidan dapat menghambat oksidasi asam linoleat yang ditandai dengan penurunan kadar oksidan hidroperoksida yang terbentuk dibandingkan kontrol. Penurunan kadar hidroperoksida berbanding lurus terhadap absorbansi dari senyawa Fe(SCN)3 dalam larutan uji (Arif et al., 2014). Hal ini berarti, profil kenaikan absorbansi tidak hanya digunakan untuk mengetahui kapan terjadinya absorbansi maksimal dan penurunan reaksi peroksidasi lipid, tetapi juga menunjukkan bahwa FEA daun Cabe Jawa positif memiliki aktivitas antioksidan atau kemampuan dalam menghambat radikal peroksida yang ditandai dengan absorbansi yang berada di bawah absorbansi kontrol negatif. Profil rata-rata absorbansi baik kontrol maupun sampel uji menunjukkan absorbansi tertinggi terjadi pada hari keenam, yang menunjukkan pembentukan peroksida terus terjadi hingga hari keenam. Kemudian absorbansi turun pada hari ketujuh yang menyiratkan bahwa mulai terjadi dekomposisi peroksida, dimana peroksida yang terbentuk akan berikatan dengan
1 2 3 4 5 6 7
Kontrol Negatif 1.597 1.722 2.068 2.149 2.186 2.193 1.950 Kontrol Positif 1.450 1.480 1.932 1.939 1.950 1.957 1.841 FEA Cabe Jawa 1.086 1.494 1.924 1.990 2.085 2.145 1.877
0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 Abs o rba ns i Hari ke- Kontrol Negatif Kontrol Positif
senyawa radikal lainnya hingga membentuk senyawa baru yang lebih stabil dan menyebabkan jumlah peroksida mulai menurun (Pane, 2013).
Adapun rata-rata absorbansi tertinggi FTC pada hari keenam inkubasi untuk ketiga replikasi kontrol negatif, BHT, dan FEA Cabe Jawa secara berturut-turut sebesar 2,193 ± 0,050, 1,957 ± 0,006, 2,145 ± 0,007. Persentase daya hambat fraksi pada hari dimana absorbansi mencapai absorbansi tertinggi menunjukkan besarnya daya penghambatan terhadap jumlah maksimal peroksida yang terbentuk. Besarnya daya hambat BHT dan FEA Cabe Jawa terhadap peroksida yang terbentuk pada hari keenam dapat dilihat pada tabel II, yang menunjukkan aktivitas penghambatan peroksidasi lipid maksimum oleh BHT lebih tinggi daripada FEA daun Cabe Jawa.
Tabel II. Total Aktivitas Antioksidan BHT dan FEA Cabe Jawa Metode FTC
Sampel Absorbansi* Persen Inhibisi*
Kontrol (-) 2,193 ± 0,050 0
BHT 1,957 ± 0,006 10,7463 ± 0,2534
FEA Cabe Jawa 2,145 ± 0,007 2,1888 ± 0,3246
Catatan: * Rata-rata ± SD, n = 3
Metode TBA juga digunakan untuk mengetahui tingkat peroksidasi lipid. Pada pH rendah dan suhu tinggi (1000C), ikatan malondialdehid-TBA akan berubah menjadi kompleks malondialdehid-TBA berwarna merah muda yang dapat diukur pada panjang gelombang 532 nm, lihat gambar 4. (Naphade et al., 2009).
Gambar 4. Reaksi Pembentukan Kompleks MDA-TBA (Sumber: Moon dan Shibamoto, 2009)
Secara teoritis, Senyawa tiga karbon malondialdehid (MDA) adalah produk dekomposisi utama karbonil pada proses autooksidasi dari lipid tak jenuh (Tamura et al., Crawford et al., Pegg et al. dalam Tokur et al., 2006). Tujuan dilakukannya pengukuran antioksidan dengan metode ini untuk mengetahui banyaknya senyawa MDA yang terbentuk, dimana senyawa ini merupakan turunan senyawa peroksida yang terbentuk pada tahap kedua reaksi peroksidasi lemak. Sehingga diharapkan hasil uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC dapat dikonfirmasikan dengan hasil TBA. Sama seperti metode FTC, semakin rendah absorbansinya maka menunjukkan aktivitas antioksidan yang semakin meningkat. Adapun hasil pengukuran rata-rata dengan metode TBA menunjukkan bahwa FEA Cabe Jawa memiliki daya hambat MDA yang sedikit lebih besar daripada kontrol positif (Tabel III).
Tabel III. Total Aktivitas Antioksidan BHT dan FEA Cabe Jawa Metode TBA
Sampel Absorbansi* Persen Inhibisi*
Kontrol (-) 1,001 ± 0,0029 0
BHT 0,168 ± 0,0073 83,2168 ± 0,7250
FEA Cabe Jawa 0,098 ± 0,0091 90,2098 ± 0,9083 Catatan: * Rata-rata ± SD, n = 3.
Seperti yang terlihat pada tabel IV, aktivitas antioksidan yang terdeteksi dengan metode TBA lebih tinggi dibandingkan dengan FTC. Menurut Aqil, et al. (2006), kemungkinan disebabkan karena peroksida yang terbentuk pada tahap awal peroksidasi lipid jumlahnya lebih besar dibandingkan jumlah turunan senyawa peroksida yang terbentuk pada tahap kedua (MDA), dan produk turunan MDA yang terbentuk lebih stabil pada beberapa waktu. Pada metode FTC, dilakukan inkubasi pada suhu 400C selama 24 jam, dan reaksi peroksidasi maksimum terjadi di hari ke-6 yang mana menunjukkan nilai absorbansi yang besar untuk BHT dan FEA Cabe Jawa walaupun tidak melebihi kontrol negatif. Nilai absorbansi yang besar (Lampiran 14a) menandakan tingginya kadar radikal peroksida yang terbentuk dan rendahnya kemampuan BHT dan FEA Cabe Jawa dalam menghambat pembentukan peroksida tersebut. Sedangkan untuk metode
TBA dilakukan pengukuran pada hari ke-8 dimana produk MDA mulai terbentuk (Rezaeizadeh, et al., 2011), dengan cara larutan dipanaskan pada suhu 950C selama 10 menit. Nilai absorbansi yang kecil (Lampiran 15a) menandakan rendahnya kadar MDA yang terbentuk dan tingginya kemampuan BHT dan FEA Cabe Jawa dalam menghambat pembentukan MDA.
Selain itu, pada tabel IV dapat dilihat perbedaan nilai %inhibisi antara BHT dan FEA Cabe Jawa pada metode FTC dan TBA. Nilai %inhibisi pada metode FTC menunjukkan daya penghambatan senyawa antioksidan dalam menghambat radikal hidroperoksida pada tahap pertama peroksidasi lipid. Sedangkan pada metode TBA, nilai %inhibisi menggambarkan daya penghambatan senyawa antioksidan dalam menghambat radikal MDA yang terbentuk pada tahap kedua peroksidasi lipid. Hasil pada tabel IV menunjukkan nilai %inhibisi BHT lebih besar daripada FEA Cabe Jawa dan nilai %inhibisi BHT lebih kecil daripada FEA Cabe Jawa pada metode TBA. Perbedaan kedua hasil ini kemungkinan dikarenakan perbedaan mekanisme antioksidan diantara keduanya. Dimana, BHT menghambat pada tahap pertama (pembentukan radikal peroksida) dan FEA Cabe Jawa menghambat pada tahap kedua (pembentukan MDA).
Tabel IV. Aktivitas Antioksidan BHT dan FEA Cabe Jawa
Sampel %Inhibisi dengan FTC %Inhibisi dengan TBA
BHT 10,7463 ± 0,2534 83,2168 ± 0,7250 FEA Cabe Jawa 2,1888 ± 0,3246 90,2098 ± 0,9083
Aktivitas antioksidan berhubungan dengan senyawa fenolik. Berdasarkan penelitian antioksidan dan total fenolik terhadap 45 tanaman obat yang dilakukan oleh Li, et al. (2008), menunjukkan nilai R2 antara kapasitas antioksidan metode FRAP dengan kandungan fenolik total 0,8672, dan kapasitas antioksidan metode TEAC dengan kandungan fenolik total 0,8500. Hasil ini menunjukkan bahwa terdapat hubungan yang signifikan antara kapasitas antioksidan dengan kandungan fenolik total. Senyawa fenolik diketahui mampu bertindak sebagai
antioksidan dengan memutuskan ikatan rantai radikal bebas secara langsung dan menangkap berbagai spesies reaktif seperti radikal superoksida, hidroksil dan peroksil dan asam hipoklorit (Kosar, et al.; Payet, et al.; Cai, et al.; Halliwell, et al. dalam Nurmi, A., 2008). Hasil penelitian Li, et al. (2008) menggambarkan korelasi yang kuat antara nilai dari metode TEAC dan FRAP dengan kandungan fenolik total yang mengimplikasikan senyawa fenolik dari tanaman-tanaman tersebut mampu bertindak sebagai antioksidan dengan menangkap radikal bebas dan reduksi oksidan. Sehingga perlu dilakukan uji korelasi untuk melihat hubungan antara kandungan fenolik total dengan nilai kapasitas antioksidan metode FTC-TBA yang dapat menggambarkan korelasi antara kandungan fenolik sebagai antioksidan terhadap peroksida yang terbentuk dari peroksidasi lipid.
KESIMPULAN
Kadar fenolik total fraksi etil asetat ekstrak metanol dari daun cabe jawa sebesar 140,43 ± 5,1219 mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat. Aktivitas antioksidan fraksi etil-asetat ekstrak metanol dari daun cabe jawa yang dinyatakan dalam %inhibisi dengan metode FTC sebesar 2,1888 ± 0,3246 % dan 90,2098 ± 0,9083 % dengan metode TBA. Fraksi etil asetat ekstrak metanol dari daun cabe jawaa memiliki daya penghambatan radikal peroksida yang lebih rendah daripada BHT, dan memiliki daya penghambatan MDA yang lebih tinggi daripada BHT.
Perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk melihat korelasi antara kandungan fenolik total terhadap mekanisme penghambatan peroksida yang terbentuk dari reaksi peroksidasi lipid.
DAFTAR PUSTAKA
Aqil, F., Ahmad, I., dan Mehmood, Z., 2006, Antioxidant and Free Radical Scavenging Properties of Twelve Traditionally Used Indian Medicinal Plants, Turk. J. Biol., 30: 177-183.
Arif D.Y., Jose, C., dan Teruna, H.Y., 2014, Total Fenolik, Flavanoid serta Aktivitas Antioksidan Ekstrak n-Heksana, Diklorometan dan Metanol Amaranthus spinosus L EM5-Bawang Putih, JOM FMIPA, 1(2): 359-369. Artini, P.U.E.D., Astuti, K.W., dan Warditiani, N.K., 2013, Uji Fitokimia Ekstrak
Etil Asetat Rimpang Bangle (Zingiber purpureum Roxb.), Jurnal Farmasi Udayana, Indonesia, 1-7.
Charles, D.J., 2013, Antioxidant Properties of Spices, Herbs and Other Sources, Springer, New York, 12.
Cicco, N., dan Lattanzio, V., 2011, The Influence of Initial Carbonate Concentration on the Folin-Ciocalteu Micro-Method for the Determination of Phenolics with Low Concentration in the Presence of Methanol: A Comparative Study of Real-Time Monitored Reactions, Am. J. Anal. Chem., 840-845.
Cindric, I.J., Kunstic, M., Zeiner, M., Stingeder, G., dan Rusak, G., 2011, Sample Preparation Methods for the Determination of the Antioxidative Capacity of Apple Juices, Croat. Chem. Acta, 84(3): 435-438.
Darwiati, W., 2013, Bioaktivitas Tiga Fraksinasi Ekstrak Biji Suren Terhadap Mortalitas Hama Daun Eurema spp., Jurnal Penelitian Hutan Tanaman, 10 (2): 99-108.
Hardiana, R., Rudiyansyah, dan Zaharah, T.A., 2012, Aktivitas Antioksidan Senyawa Golongan Fenol dari Beberapa Jenis Tumbuhan Famili Malvaceae, JKK, 1(1): 8-13.
Kawamura, F., Ramle, S.F.M., Sulaiman, O., Hashim, R., dan Ohara, S., 2011, Antioxidant and Antifungal Activities of Extracts from 15 Selected Hardwood Species of Malaysian Timber, Eur. J. Wood Prod., 69: 207-212. Khoddami, A., Wilkes, M.A., dan Roberts, T.H., 2013, Techniques for Analysis
of Plant Phenolic Compounds, Molecules, 18: 2328-2375.
Kusumanto, Y.K.E.P., 2015, Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Metode Deoksiribosa dan Penetapan Kandungan Fenolik Total pada Fraksi Etil Asetat Ektrak Etanol Buah Jambu Mete (Anacardium occidentale L.), Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta, 25-26. Lamid, A., 1995, Vitamin E sebagai Antioksidan, Media Litbangkes, V (01):
14-16.
Lee, K.W., Kim, Y.J., Lee, H.J., dan Lee, C.Y., 2003, Cocoa Has More Phenolic Phytochemicals and A Higher Antioxidant Capacity Than Teas and Red Wine, J. Agric. Food Chem., 51: 7292-7295.
Li, H.B., Wong, C.C., Cheng, K.W., dan Chen, F., 2008, Antioxidant Properties in Vitro and Total Ohenolic Contents in Methanol Extracts from Medicinal Plants, LWT, 41: 385-390.
Lim, T.K., 2012, Edible Medicinal and Non-Medicinal Plants, Volume 4, Springer, Netherlands, 351-357.
Moon, J.K., dan Shibamoto, T., 2009, Review: Antioxidant Assay for Plant and Food Components, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57: 1655-1666.
Nahak, G., dan Sahu, R.K., Phytochemical Evaluation and Antioxidant Activity of Piper cubeba and Piper nigrum, Journal of Applied Pharmaceutical Science, 01(08): 153-157.
Naphade, S.S., Khadabadi, S.S., Deore, S.L., Jagtap, N.S. dan Hadke, S.P., 2009, Antioxidant Activity of Different Extract of Plant Tricholepis Glaberrima DC (Ateraceae), International Journal of PharmaTech Research, Government Collage of Pharmacy and Phytochemistry Departement, 1(3): 502-505.
Nurmi, A., 2008, Antioxidant Studies on Selected Lamiaceae Herbs In Vitro and In Humans, Yliopistopaino, University Print, Helsinki, Finland, 33. Pane, E.R., 2013, Uji Aktivitas Senyawa Antioksidan dari Ekstrak Metanol Kulit
Pisang Raja (Musa paradisiaca Sapientum), Valensi, 3(2): 76-81.
Parida, R., dan Dhal, Y., 2011, A Study on The Micro-Propagation and Antioxidant Activity of Piper longum ( An Important Medicinal Plant ), Journal of Medicinal Plants Research, 5(32): 6691-6994.
Parmar, V.S., Jain, S.C., Bisht, K.S., Jain, R., Taneja, P., Jha, A., Tyagi, O.D., Prasad, A.K., Wengel, J., Olsen, C.E., dan Boll, P.M., 1997, Phytochemistry of The Genus Piper, Phytochemistry, 46(4): 597-673. Prasad M.P., Sushant S., dan Babhulkar A., 2012, Phytochemical Analysis and
Antioxidant Potential of Piper Species and Its Molecular Characterization by RAPD Markers, International Journal of Fundamental & Applied Sciences, 1(4): 71-73.
Rami, E., Sipai, S., dan Patel, I., 2013, Studies on Qualitative and Quantitative Phytochemical Analysis of Piper Longum Linn., International Journal of Pharma and Bio Scienes, 4(3): 1381-1388.
Rezaeizadeh, A., Zuki, A.B.Z., M., Abdollahi, Goh, Y.M., Noordin, M.M., Hamid, M., dan Azmi, T.I., 2011, Determination of Antioxidant Activity in Methanolic and Cloroformic Extracts of Momordica charantia, African Journal of Biotechnology, 10(24): 4932-4940.
Risdian, C., Widowati, W., Mozet, T., Wargasetia, T.L., dan Khong, K., 2011, Free Radical Scaveging Activity of Ethanolic Leaves Extract and Its Different Solvent Fractions of Piper betle L. In Vitro, Indonesian Journal of Cancer Chemoprevention, 2(1): 141-145.
Sasikumar, J.M., Maheshu, V., dan Jayadev, R., 2009, In Vitro Antioxidant Activity of Methanolic Extracts of Berberis Tinctoria Lesch. Root and Root Bark, India Journal of Herbal Medicine and Toxicology, 3(2): 53-58.
Setyowati, E.P., Jenie, U.A., Sudarsono, Kardono, B., Rahmat, R., dan Meiyanto, E., 2007, Isolasi Senyawa Sitotoksik Spons Kaliapsis, Majalah Farmasi Indonesia, 18(4): 183-189.
Soegihardjo, C.J., 2013, Farmakognosi, PT. Citra Aji Parama, Yogyakarta, 10-11. Thitilertdecha, N., Teerawutgulrag, A., Kilburn, J.D., dan Rakariyatham, N.,
2010, Identification of Major Phenolic Compound from Nephelium lappaceum L. and Their Antioxidant Activities, Molecules, 15: 1453-1465.
Tokur, B., Korkmaz, K., dan Ayas, D., 2006, Comparison of Two Thiobarbituric Acid (TBA) Method for Monitoring Lipid Oxidation in Fish, Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, Vol. 23, Issue (3-4): 331-334.
Umemura, T., Kodama, Y., Hioki, K., Inoue, T., Nomura, T., dan Kurokawa, Y., 2001, Butylhydroxytoluene (BHT) Increases Susceptibility of Transgenic rasH2 Mice to Lung Carcinogenesis, Journal of Cancer Research and Clinical Oncology, 127 (10): 583-590.
United States Departement of Agriculture (USDA), 2015, Classification: Piper retrofractum Vahl., http://plants.usda.gov/core/profile?symbol=PIRE9, diakses pada tanggal 02 Maret 2016 pukul 18.23 WIB.
Winarsi, H., 2007, Antioksidan Alami & Radikal Bebas : Potensi dan Aplikasinya dalam Kesehatan, Kanisius, Yogyakarta, 13-15, 17, 20, 49-60.
Lampiran 2. Klasifikasi Tanaman Cabe Jawa
Menurut United States Department of Agriculture (2016), klasifikasi dari tanaman Cabe Jawa sebagai berikut.
Kerajaan : Plantae Sub-Kerajaan : Tracheobionta Superdivisi : Spermatophyta Divisi : Magnoliophyta Kelas : Magnoliopsida Sub-Kelas : Magnoliidae Ordo : Piperales Suku : Piperaceae Genus : Piper L.
Lampiran 3. Penimbangan dalam Pembuatan Simplisia
Berat Tanaman Segar Cabe Jawa = 1 kg = 1000 gr ( Timbangan Pemasok )
Penimbangan Hasil Sortasi Basah Daun Cabe Jawa
Berat Wadah Kosong = 3.00 gram Berat Wadah Kosong + Daun = 597.77 gram Berat Daun = 594.77 gram
Penimbangan Hasil Sortasi Kering Daun Cabe Jawa
Berat Wadah Kosong = 229.50 gram Berat Wadah Kosong + Daun = 408.37 gram Berat Daun = 178.87 gram
Penimbangan Hasil Penyerbukan Simplisia Daun Cabe Jawa Berat Wadah Kosong = 13.365 gram Berat Wadah Kosong + Daun = 314.450 gram Berat Daun = 301.085 gram
Penimbangan Hasil Pengayakan Serbuk Simplisia Daun Cabe Jawa Berat Wadah Kosong = 133.57 gram Berat Wadah Kosong + Daun = 202.50 gram Berat Daun = 68.93 gram
Lampiran 4. Perhitungan Penetapan Kadar Air Simplisia Daun Cabe Jawa Kadar Air Simplisia =
Keterangan Berat Simplisia (g) Kadar Air (%) Rata-Rata Awal Akhir Replikasi 1 5.198 4.882 6.079 6.422 ± 0.2436 Replikasi 2 5.166 4.827 6.562 Replikasi 3 5.178 4.835 6.624 Replikasi 1
Kadar Air Simplisia =
= 6.079 %
Replikasi 2
Kadar Air Simplisia =
= 6.562 %
Replikasi 1
Kadar Air Simplisia =
= 6.624 %
Lampiran 5. Perhitungan Rendemen Ekstrak dan Fraksi Daun Cabe Jawa Rumus Perhitungan:
a. Ekstrak Metanol Daun Cabe Jawa
Berat (gram) Rendemen Ekstrak (%)
Bobot simplisia yang digunakan 53.9297
7.8979
Bobot cawan kosong 53.0113
Bobot cawan + ekstrak 57.2706
Bobot ekstrak 4.2593
%Rendemen Ekstrak = (4.3593/53.9297) x 100%
= 7.8979 %
b. Fraksi Etil Asetat Daun Cabe Jawa
Berat (gram) Rendemen Fraksi (%) Bobot simplisia yang digunakan 53.9297
2.3362 Bobot cawan kosong 53.0308
Bobot cawan + ekstrak 54.2907
Bobot ekstrak 1.2599
%Rendemen Fraksi = (1.2599/53.9297) x 100%
Lampiran 6. Data Penimbangan untuk Penetapan Kandungan Fenolik a. Penimbangan Asam Galat
Replikasi 1 (gram) Replikasi 2 (gram) Replikasi 3 (gram) Bobot Beker 63.7284 61.4635 62.1535
Bobot Beker + zat 63.7385 61.4735 62.1636
Bobot Zat 0.0101 0.0100 0.0101
b. Penimbangan Fraksi Etil Asetat Daun Cabe Jawa
Replikasi 1 (gram) Replikasi 2 (gram) Replikasi 3 (gram) Bobot Cawan P. 27.9172 22.7570 27.1513 Bobot Cawan + zat 27.9272 22.7670 27.1613 Bobot Zat 0.0100 0.0100 0.0100
Lampiran 7. Data Perhitungan Konsentrasi Asam Galat dan Fraksi Etil Asetat untuk Penetapan Kandungan Fenolik Total
a. Perhitungan Konsentrasi Asam Galat
Bobot Asam Galat diencerkan dalam labu takar 10 ml:
Replikasi 1 = 0.0101 g = 10.1 mg C = 1.01 mg/ml Replikasi 2 = 0.0100 g = 10.0 mg C = 1.00 mg/ml Replikasi 3 = 0.0101 g = 10.1 mg C = 1.01 mg/ml
Seri Konsentrasi Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 1 40.4 μg/ml 40 μg/ml 40.4 μg/ml 2 50.5 μg/ml 50 μg/ml 50.5 μg/ml 3 60.6 μg/ml 60 μg/ml 60.6 μg/ml 4 70.7 μg/ml 70 μg/ml 70.7 μg/ml 5 80.8 μg/ml 80 μg/ml 80.8 μg/ml
Contoh Perhitungan Seri Konsentrasi Replikasi 1
Seri 1: 0.4 ml x 1.01 mg/ml = 10 ml x C2 C2= 0.0404 mg/ml = 40.4 μg/ml Seri 2: 0.5 ml x 1.01 mg/ml = 10 ml x C2 C2= 0.0505 mg/ml = 50.5 μg/ml Seri 3: 0.6 ml x 1.01 mg/ml = 10 ml x C2 C2 = 0.0606 mg/ml = 60.6 μg/ml Seri 4: 0.7 ml x 1.01 mg/ml = 10 ml x C2 C2= 0.0707 mg/ml = 70.7 μg/ml Rumus Pengenceran: V1 C1 = V2 C2
Seri 5:
0.8 ml x 1.01 mg/ml = 10 ml x C2 C2= 0.0808 mg/ml = 80.8 μg/ml
b. Perhitungan Konsentrasi Fraksi Etil Asetat Konsentrasi
Fraksi Etil Asetat Daun Cabe Jawa
Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3
200 μg/ml 200 μg/ml 200 μg/ml
Bobot Fraksi Etil Asetat Daun Cabe Jawa yang diencerkan dalam labu takar 10 ml: Replikasi 1 = 0.0100 g = 10.0 mg C = 1.00 mg/ml
Replikasi 2 = 0.0100 g = 10.0 mg C = 1.00 mg/ml Replikasi 3 = 0.0100 g = 10.0 mg C = 1.00 mg/ml
Contoh Perhitungan Pengenceran Konsentrasi Replikasi 1 V1 C1 = V2 C2
2 ml x 1.00 mg/ml = 10 ml x C2
C2= 0.200 mg/ml = 200 μg/ml
Lampiran 8. Hasil Optimasi Operating Time untuk Penetapan Kandungan Fenolik Total
a. Replikasi 1
OT Absorbansi konsentrasi asam galat pada 750 nm
40 μg/ml 60 μg/ml 80 μg/ml
5 0.345 0.406 0.581
15 0.379 0.529 0.633 20 0.387 0.535 0.650 25 0.399 0.538 0.653 30 0.402 0.544 0.664 35 0.404 0.543 0.664 40 0.414 0.543 0.661 45 0.418 0.544 0.659 50 0.420 0.543 0.665 55 0.423 0.544 0.667 60 0.425 0.544 0.665
Pada replikasi 1, OT yang didapat 30 menit.
b. Replikasi 2
OT Absorbansi konsentrasi asam galat pada 750 nm
40 μg/ml 60 μg/ml 80 μg/ml 5 0.341 0.401 0.574 10 0.366 0.482 0.607 15 0.376 0.528 0.626 20 0.382 0.545 0.635 25 0.385 0.549 0.640 30 0.386 0.551 0.640 35 0.386 0.550 0.640 40 0.386 0.551 0.639 45 0.386 0.549 0.639 50 0.386 0.552 0.639 55 0.385 0.533 0.638 60 0.385 0.553 0.638
c. Replikasi 3
OT Absorbansi konsentrasi asam galat pada 750 nm
40 μg/ml 60 μg/ml 80 μg/ml 5 0.344 0.408 0.581 10 0.368 0.490 0.610 15 0.377 0.532 0.627 20 0.384 0.544 0.636 25 0.386 0.549 0.640 30 0.386 0.548 0.641 35 0.387 0.548 0.640 40 0.386 0.549 0.640 45 0.386 0.549 0.640 50 0.386 0.550 0.639 55 0.385 0.537 0.638 60 0.385 0.546 0.638
Lampiran 9. Hasil Optimasi Panjang Gelombang Maksimal untuk Penetapan Kandungan Fenolik Total
Lampiran 10. Hasil Pengukuran Kurva Baku untuk Penetapan Kandungan Fenolik Total
a. Replikasi 1
Seri Konsentrasi Absorbansi Persamaan Kurva Baku
1 40.4 μg/ml 0.349 y = 0.00711x + 0.07 r = 0.9831 2 50.5 μg/ml 0.430 3 60.6 μg/ml 0.499 4 70.7 μg/ml 0.606 5 80.8 μg/ml 0.620 b. Replikasi 2
Seri Konsentrasi Absorbansi Persamaan Kurva Baku
1 40.0 μg/ml 0.390 y = 0.00618x + 0.1264 r = 0.9894 2 50.0 μg/ml 0.419 3 60.0 μg/ml 0.484 4 70.0 μg/ml 0.569 5 80.0 μg/ml 0.624 c. Replikasi 3
Seri Konsentrasi Absorbansi Persamaan Kurva Baku
1 40.4 μg/ml 0.369 y = 0.00662x + 0.0974 r = 0.9924 2 50.5 μg/ml 0.424 3 60.6 μg/ml 0.492 4 70.7 μg/ml 0.587 5 80.8 μg/ml 0.622
Lampiran 11. Perhitungan Kandungan Fenolik Total FEA Cabe Jawa Konsentrasi Absorbansi Kandungan
Fenolik Total Rata-rata %CV Replikasi 1 200 μg/ml 0.274 133.40
140.43 ±
5.1219 3.6472% Replikasi 2 200 μg/ml 0.286 142.45
Replikasi 3 200 μg/ml 0.290 145.45
Contoh perhitungan kandungan fenolik total: a. Replikasi 1 y = 0.00662x + 0.0974 0.274 = 0.00662x + 0.0974 x = 0.274-0.0974/0.00662 = 26.6767 μg/ml x = 0.0266767 mg/ml 0.02668 mg/ml Bobot fraksi = 0.0100 gram
Rumus Perhitungan:
C = x , sehingga:
Kandungan fenolik total = 0.02668 x 50/0.0100
= 133.4 mg/gram
Jadi, kandungan fenolik total dalam sampel replikasi 1 sebesar 133.4 mg asam galat ekuivalen per gram fraksi etil asetat.
Lampiran 12. Data Penimbangan untuk Uji Aktivitas Antioksidan Metode FTC- TBA
a. Penimbangan BHT untuk Optimasi Metode
OT (gram) Lamda (gram)
Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Berat Cawan Kosong 63.0377 61.5081 61.7617 63.6569 Berat Cawan + sampel 63.0418 61.5122 61.7657 63.6609 Berat Sampel 0.0041 0.0040 0.0040 0.0040
b. Penimbangan Sampel Uji
BHT (gram) FEA Cabe Jawa (gram) Rep 1 Rep 2 Rep 3 Rep 1 Rep 2 Rep 3 Berat Cawan Kosong 62.4275 61.0764 61.4654 23.3755 22.8067 28.0020 Berat Cawan + sampel 62.4316 61.0805 61.4695 23.3796 22.8109 28.0059
Berat Sampel 0.0041 0.0041 0.0041 0.0041 0.0042 0.0039
Lampiran 13. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan FTC-TBA a. Penentuan Operating Time (OT)
Hasil OT, CBHT = 4 mg
OT (Menit ke-) Absorbansi (Triplo)
Pengukuran 1 Pengukuran 2 Pengukuran 3
1 0.985 0.959 0.948
3 0.918 0.907 0.899
5 0.875 0.875 0.874
7 0.864 0.862 0.860
b. Penentuan Lamda Max Replikasi 1
Lampiran 14. Hasil Data Uji Aktivitas Antioksidan Metode FTC
a. Nilai Absorbansi Kontrol Negatif, Kontrol Positif dan Fraksi Etil-Asetat
Berdasarkan hasil pengukuran absorbansi kontrol negatif dengan spektrofotometer UV/Vis maka dapat disimpulkan bahwa pada hari ke-6 reaksi peroksidasi lipid telah mencapai batas maksimum.
b. Profil Absorbansi Kontrol Negatif, Kontrol Positif dan Fraksi Etil Asetat
Hari Ke- Mean ± SD
Kontrol (-) Kontrol (+) Sampel