Analysis dynamic of structure mutan glucose oxsidase IPBBC as substrate binding in silico Asrul Fanani1, Laksmi Ambarsari1*, Popi Asri Kurniatin1, Setyanto Tri Wahyudi2 1)Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor, Bogor 16680, Indonesia
2)Departemen Fisika, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor, Bogor 16680, Indonesia
*)Korespondensi penulis: laksmi@apps.ipb.ac.id
Abstrak
Glukosa oksidase (GOD) merupakan enzim oksidoreduktase yang mengkatalisis oksidasi β-D-Glukosa menjadi asam glukonat dan hidrogen peroksida menggunakan oksigen molekuler sebagai akseptor elektron. Pemanfaatan enzim ini paling banyak digunakan sebagai bahan biosensor gula darah. Saat ini tengah berkembang penelitian mengenai pemanfaatan enzim glukosa oksidase sebagai biofuel cell, namun penggunaannya masih belum efektif. Dari penelitian yang telah dilaporkan enzim glukosa oksidase kehilangan aktifitasnya ketika konsentrasi glukosa (substrat) meningkat (100 mM). Dengan demikian diperlukan enzim GOD yang memiliki nilai Km tinggi untuk dapat digunakan sebagai biofuel cell. Enzim glukosa oksidase dari Aspergilus niger IPBCC-08.610 (GOD-IPBCC) dalam keadaan murni memiliki aktivitas total sebesar 92.87 U dan nilai Km sebesar 17.41 mM sebagai biosensor. Berdasarkan kemampuan kerja enzim GOD-IPBCC perlu dilakukan modifikasi untuk meningkatkan nilai Km enzim agar dapat diaplikasikan sebagai biofuel cell. Penelitian ini dilakukan untuk menganalisis prediksi mutasi terbaik pada sturktur enzim GOD-IPBCC yang mampu meningkatkan nilai Km. Analisis molekuler docking dilakukan menggunakan Autodock Vina, dan analisis hasil molekuler docking menggunakan Ligplus+. Penelitian ini menggunakan tiga jenis mutasi yaitu E412C, E412K, dan E412W. Hasil analisis menunjukkan mutasi E412C memberikan kenaikan pada nilai Km (47.06 µM) dari nilai Km wild-tipe (39.75 µM). Hasil ini menunjukkan bahwa mutan E412C memiliki potensi yang dapat meningkatkan enzim GOD-IPBCC sebagai biofuel cell.
[Kata kunci: Biofuel cell, biosensor, molekuler docking, wild-type]
Pendahuluan
Glukosa oksidase (GOD) merupakan enzim oksidoreduktase yang mengkatalisis oksidasi β-D-Glukosa menjadi asam glukonat dan hidrogen peroksida menggunakan oksigen molekuler sebagai akseptor elektron (Mano 2019). GOD memiliki struktur homodimer yang terdiri dari dua subunit identik dengan berat molekul 150.000 Dalton. Setiap monomer GOD mengandung satu molekul kofaktor yaitu flavin adenina dinukleotida (FAD), kofaktor ini terikat secara non-kovalen dan bertindak sebagai pembawa redoks dalam reaksi
enzimatisnya (Gutierrez et al. 2018; Tu et al. 2019). Glukosa oksidase dapat diaplikasikan sebagai bahan pemutih tekstil, pengawet makanan dan untuk produksi asam glukonat (Dubey et al., 2017; Cruz et al., 2012; Reyes et al., 2018; Ferri et al., 2011), dan aplikasi GOD yang paling banyak digunakan adalah sebagai biosensor glukosa darah (Subiyono et al. 2016). Kelebihan dari enzim GOD dibandingkan dengan enzim lain adalah karena sifat enzim ini memiliki spesifisitas yang tinggi terhadap glukosa, potensial redoks rendah dan memiliki termostabilitas yang baik sehingga banyak digunakan (Vogt et al., 2014; Leskovac et
Seminar Nasional Bioteknologi | 2020
71
al., 2005). Penelitian baru-baru ini tengah mengembangkan potensi GOD untuk dapat digunakan sebagai biofuel cell (Bobrowski and Schuhmann 2018; Bollella and Gorton 2018; Ostafe et al., 2020). Dalam pengembangannya
GOD menemui beberapa permasalahan
diantaranya adalah enzim GOD kehilangan aktifitasnya ketika konsentrasi glukosa (substrat) meningkat (100 mM). Dengan demikian diperlukan pengembangan lebih lanjut terhadap enzim GOD untuk dapat diaplikasikan sebagai biofuel cell. Salah satu cara yang dapat digunakan adalah dengan melakukan modifikasi terhadap struktur enzim untuk menaikkan konstanta Michaelis-menten (Km).
Enzim glukosa oksidase dari Aspergilus niger IPBCC-08.610 (GOD-IPBCC) diketahui memiliki aktivitas total sebesar 92.87 U (Triana 2013) dan nilai Km sebesar 17.41 mM sebagai biosensor (Nurlita 2017). Berdasarkan kemampuan kerja enzim GOD-IPBCC perlu dilakukan modifikasi pada struktur enzim untuk meningkatkan nilai Km. Penelititan ini dilakukan untuk mengetahui dinamika struktur mutan enzim GOD-IPBCC pada peningkatan nilai Km dan untuk mengetahui pengaruh mutasi terhadap pengikatan substrat secara komputasi. Struktur 3 dimensi enzim GOD-IPBCC yang digunakan dalam penelitian ini merupakan struktur hasil prediksi dari urutan kode genetik yang telah dilakukan simulasi dinamika molekuler (MD) 50ns (Maulana et al., 2019).
Bahan dan Metode Bahan penelitian
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah struktur 3 dimensi enzim GOD-IPBCC hasil prediksi (Maulana et al., 2019) dari urutan asam amino yang diperoleh dari NCBI dengan nomor akses MH593586.1 (Khanza 2016) dan ligan yang digunakan adalah β-D-Glukosa dengan struktur ligan didapat dari database PubChem.
Preparasi ligan dan reseptor
Struktur ligan yang diunduh melalui situs web PubChem dalam format *sdf dan dikonversi ke format *pdb menggunakan perangkat lunak Marvin View. Atom hidrogen polar ditambahkan
menggunakan Discovery Studio Visualizer 2019 Client dan disimpan sebagai Ligan.pdb.
Reseptor GOD-IPBCC hasil simulasi MD 50ns dibersihkan dari molekul pengotor seperti ligan dan air yang masih melekat pada protein, kemudian atom hidrogen polar ditambahkan. Preparasi ini menggunakan perangkat lunak Discovery Studio Visualizer 2019 Client. Reseptor kemudian disimpan dalam format *pdb.
Mutasi reseptor menggunakan Chimera 1.14 Pada penelitian ini mutasi dilakukan pada residu E412 dengan mengganti residu E (glutamate) menjadi C (sistein), K (lisin), dan W (triptofan) dengan penulisan secara umum E412C, E412K, dan E412W (Gambar 1). File reseptor dalam format *.pdb dibuka menggunakan software Chimera 1.14. Mutasi dilakukan dengan membuka jendela urutan asam amino pembangun struktur enzim dan memilih residu yang akan dimutasi. Sebelum dilakukan mutasi, perlu ditampilkan residu-residu yang ada di sekitar asam amino dengan rentang 5 angstroms untuk mengetahui probabilitas kedekatan gugus R dari masing-masing asam amino. Pemilihan berubahan bentuk residu asam amino ditentukan dari probilitas kedekatan gugus R terbaik yang tidak saling bertabrakan dengan residu asam amino lainnya dalam rentang 5 angstroms. Reseptor bermutasi yang dihasilkan kemudian disimpan dalam format *pdb.
Simulasi docking ligan dan reseptor
File reseptor dan ligan dibuka menggunakan AutoDockTools 1.5.6. Jumlah torsi ligan ditentukan dan disimpan sebagai Ligan.pdbqt. dan juga reseptor disimpan dengan format *pdbqt. Parameter docking dilakukan dengan memilih Ligan.pdbqt dan reseptor.pdbqt. Penempatan koordinat ligan (Grid Box) diposisi berada dalam kordinat residu katalitiknya, dan simulasi docking dilakukan dengan menggunakan file config.txt hasil output dari penentuan Grid-box dan dijalan simulasi docking menggunakan perangkat autodock vina dengan bantuan Command Prompt (CMD).
Analisis interaksi antara ligan dan reseptor menggunakan LigPlot + 1.5.4
File hasil docking dibuka menggunakan Discovery Studio Visualizer 2019. Langkah
Seminar Nasional Bioteknologi | 2020
72
pertama dengan energi Gibbs terbaik dipilih dan disalin ke file reseptor. File reseptor yang dipilih berisi struktur ligan dalam format .pdb. File tersebut kemudian dianalisis menggunakan Ligplot + 1.4.5. Hasil analisis yang terdiri dari gambar 2D interaksi antara ligan dan protein menunjukkan ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik dengan panjang/jarak ikatan
Hasil dan Pembahasan Karakterisasi struktur GOD-IPBCC
Dalam penelitian sebelumnya telah dilaporkan urutan kode genetik enzim GOD-IPBCC, kode genetik didapat dari amplifikasi DNA genom dengan primer spesifik dan dikarakterisasi melalui teknik restriksi dengan endonuklease EcoRI dan PstI. Selain itu, kode genetik disisipkan pada vektor pGEM®T-Easy dan ditransformasikan pada sel kompeten E. coli DH5α untuk mendapatkan urutan basa nitrogennya dan untuk mengakses kode genetik enzim dapat dilihat pada database NCBI dengan nomor akses MH593586.1 (Khanza 2016). Berdasarkan urutan kode genetik yang
didapat, struktur 3 dimensi dari enzim GOD-IPBCC berhasil diprediksi melalui metode homologi atau pensejajaran struktur asam amino dengan struktur enzim glukosa oksidase lain yang sudah ada sebelumnya. Hasil yang diperoleh struktur genetik GOD-IPBCC memiliki kesamaan terbaik dengan GOD 1CF3 sebesar 97%.
Kualitas kedua struktur prediksi GOD_IPBCC dievaluasi secara geometri menggunakan distribusi tiap-tiap residu yang diplot dalam satu koordinat Ramachandran. Hasil plot menunjukkan 89.4% residu pembentuk struktur GOD-IPBCC-1CF3 menempati daerah yang disukai dan 89.2% untuk GOD-IPBCC-5NIT. Hasil analisis residu katalitik, diketahui bahwa enzim GOD-IPBCC memiliki dua daerah fungsional dan tiga residu katalitik (E412, H516 dan H559). Lebih jauh, struktur 3 dimensi GOD_IPBCC dianalisis menggunakan simulasi dinamika molekul (MD) dan memperoleh hasil struktur enzim GOD-IPBCC mampu bertahan hingga akhir waktu simulasi, yang menandakan struktur enzim stabil dalam suhu lingkungan (Maulana et al., 2019).
Gambar 1. Lokasi mutasi dan jenis mutasi yang dilakukan pada struktur GOD-IPBCC (E : glu; C : cys; K : lys; W : trp)
Figure 1. Location of mutations and types of mutation carried out in the GOD-IPBCC (E : glu; C : cys; K : lys; W : trp)
Tabel 1. Perbandingan prediksi struktur GOD-IPBCC bedasarkan Ramachandran plot (Maulana et al., 2019)
Seminar Nasional Bioteknologi | 2020
73
Gambar 2. Struktur enzim GOD-IPBCC dan letak residu katalitik
Figure 2. Enzyme structure of GOD-IPBCC and its active site location
Gambar 3. Perbandingan struktur prediksi GOD-IPBCC a) menggunakan template 1CF3, b) menggunakan template 5NIT (Maulana et al., 2019)
Seminar Nasional Bioteknologi | 2020
74
Molekuler docking dan penentuan daerah penambatan
Penambatan molekuler yang dilakukan dalam penelitian ini menggunakan ligan β-D-Glukosa dan reseptor GOD-IPBCC hasil MD 50ns. Hasil penambatan molekuler akan diperoleh data energy afinitas (∆G) dan root mean square deviation (RSMD). Hasil pose ligan kemudian dianalisis lebih lanjut menggunakan software Ligplot+ untuk mengetahui pose ikatan ligan dan reseptor yang terjadi. Molekuler docking yang dilakukan memperoleh hasil ligan β-D-Glukosa tertambat pada reseptor dengan afinitas energi sebesar -6.0 kcat/mol, membentuk ikatan hidrogen dengan residu Thr110, Arg512, Asn514, His559, FAD dan ikatan hidrofobik dengan Trp426, Tyr515. Untuk memvalidasi hasil docking dilakukan pembandingan dengan model pose pengikatan ligan oleh glukosa oksidase 1CF3. Pemilihan β-D-Glukosa sebagai ligan dalam penelitian ini didasarkan pada kualitas β-D-Glukosa yang memberikan aktivitas terbaik pada kerja enzim glukosa oksidase (Leskovac et al., 2005; Wohlfahrt et al., 1999). β-D-Glukosa memiliki afinitas 20 kali lipat lebih baik jika dibandingkan dengan monosakarida lain.
Mutasi struktur GOD-IPBCC
Dalam penelitian ini mutasi pada struktur GOD-IPBCC dilakukan pada residu katalitik E412. Hal ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh mutasi pada residu katalitik, tersebut, karena dalam peran katalitiknya residu ini tidak berikatan secara langsung dengan ligan melainkan berperan sebagai penstabil residu H559 (histidine 559) yang berikatan langsung dengan ligan, sehingga mutasi ini perlu dilakukan.
Bentuk mutasi yang dilakukan dalam penelitian adalah dengan menggantikan residu E412 menjadi menjadi bentuk residu lain, yaitu E412C (sistein), E412K (lisin), dan E412W (triptofan). Proses mutasi dilakukan menggunakan software Chimera 1.14. Setelah dilakukan mutasi, analisis lebih jauh dilakukan untuk mengetahui kualitas struktur mutan GOD-IPBCC yang dievaluasi secara geometri melalui distribusi tiap-tiap residu yang diplot dalam satu koordinat Ramachandran. Hasil plot Ramachandran diperoleh data bahwa mutan E412C, E412K dan E412W menempati daerah yang disukai sebesar 91.2%, 90.8% dan 90.6% secara berurutan, dan menempati daerah yang diizinkan sebesar 8.8%, 9.2%, dan 9.4%, dan tidak berada di daerah yang terlarang (0%). Table 2. Perbandingan data hasil analisis Ramachandran plot
reseptor wild-type dan mutan GOD-IPBCC
Table 2. Comparison of data from the analysis of the
Ramachandran wild type receptor plot analysis and the GOD-IPBCC mutant RESEPTOR DAERAH YANG DISUKAI (%) DAERAH YANG DIIZINKAN (%) DAERAH YANG DILARANG (%) WILD-TYPE 91,0 9,0 0,0 E412C 91,2 8,8 0,0 E412K 90,8 9,2 0,0 E412W 90,6 9,4 0,0
Analisis geometri menggunakan Ramachandran plot untuk mengukur kualitas struktur protein dikatakan sebagai struktur yang baik apabila besar presentase residu yang terlokalisasi pada daerah yang disukai minimal 90%. Dari hasil analisis yang telah dilakukan diketahui bahwa struktur mutan E412C memiliki hasil yang lebih baik dibandingkan dengan struktur WT dan struktur mutan lainnya.
Gambar 4. Visualisasi hasil analisis Ligplus+ antara ligan β-D-Glukosa (Glc 700) dengan GOD 1CF3 (kiri) dan antara ligan β-D Glukosa (Unk0) dengan GOD-IPBCC (kanan)
Figure 4. Results visualization of ligplus+ analysis between β-D-Glucose ligand (Glc 700) with GOD 1CF3 (left) and between β-D-Glucose ligands (Unk0) and GOD-IPBCC (right)
Seminar Nasional Bioteknologi | 2020
75
a b c
Gambar 5. Ramachandran plot mutan GOD-IPBCC a) E412C, b) E412K, c) E312W
Figure 5. Ramachandran plot of mutan GOD-IPBCC a) E412C, b) E412K, c) E412W
Molekuler docking mutan GOD-IPBCC
Mutasi merupakan metode yang membuat perubahan terhadap struktur enzim dari urutan genetikanya, ketika terjadi perubahan urutan kode genetik hal tersebut akan memicu perubahan struktur dan juga akan mengakibatkan perubahan selektifitas dan kemampuan kerja dari enzim. Berdasarkan penelitian yang telah dilaporkan banyak berkembang berbagai jenis mutasi untuk meningkatkan efektifitas penggunaan enzim glukosa oksidase dalam berbagai bidang terutama sebagai biosensor dan biofuel cell (Leskovac 2005, Mu 2019, Petrovic 2017, Dubey 2017). Biofuel cell adalah jenis sel bahan bakar yang didasarkan pada kemampuan enzim sebagai katalis. Pemanfaatan enzim glukosa oksidase sebagai biofuel cell masih belum efektif penggunaannya, karena umur yang pendek dan tidak menghasilkan banyak tenaga (Elouarzaki et al. 2018). Menurut penelitian Chen dan Yu (2009) densitas daya maksimum (Pmax) biofuel cell mencapai jenuh ketika [Glukosa] ≥ 20 mM, hal ini menjelaskan mengapa biofuel cell dengan glukosa 100 mM tidak memiliki respon. Untuk glukosa tambahan dalam penelitiannya. Dengan demikian peningkatan nilai Km dapat meningkatkan pemanfaatan enzim sebagai biofuel cell.
Dalam reaksi kimia, konstanta Michaelis-Menten secara numerik sama dengan konsentrasi substrat pada setengah dari laju reaksi maksimum (Vmax), dimana nilai Km sama dengan nilai Kd. Dalam penelitian ini nilai Kd diasumsikan sama
dengan nilai Km. Dalam penentuan nilai Km menggunakan persamaan sebagai berikut:
∆G = RT ln(Km)
*Keterangan: ∆G: energy affinity (cal/mol), R: konstanta gas (cal/K), T: suhu (K), Km: konstanta Michaelis-menten
Dari hasil molekuler docking mutan GOD-IPBCC diketahui bahwa profil energi afinitasnya (∆G) tidak memberikan hasil yang berbeda secara signifikan, karena hanya menyebabkan perubahan ± 0.1 kcat/mol dari keadaan WT-nya. Sedangkan profil nilai Km mutan GOD-IPBCC memberikan hasil yang terlihat jelas perbedaannya, pada mutan E412C menyebabkan perubahan nilai Km menjadi 47,06 µM, mutan E412K tidak mengalami perubahan atau tetap (39,47 µM) dan mutan E412W menurunkan nilai Km menjadi 33,57 µM. Data perbandingan dapat dilihat pada Tabel 3.
Analisis lebih lanjut dilakukan menggunakan software Ligplus+ untuk mengetahaui residu-residu yang berperan dalam pengikatan ligan β-D-Glukosa dari hasil molekuler docking. Dari hasil analisis diketahui tiga struktur mutan enzim GOD-IPBCC tidak mengalami perubahan pengikatan ligan oleh reseptor, yaitu pose pengikatannya sama dengan struktur wild-type, baik dalam ikatan hidrogen dan juga hidrofobiknya. Hal ini memberikan informasi bahwa mutasi yang dilakukan pada residu E412 tidak memberikan pengaruh yang signifikan terhadap pengikatan ligan.
Seminar Nasional Bioteknologi | 2020
76
Tabel 3. Data interaksi hasil molekuler docking dan nilai Km reseptor wild-type dan mutan GOD-IPBCC dengan ligan β-D-Glukosa
Table 3. Data interaction of docking molecular results and Km values of wild-type receptor and GOD-IPBCC mutants with β-D-Glucose ligand
LIGAN RESEPTOR ∆G
(KCAT/MOL)
KM
(µM) IKATAN HIDROGEN IKATAN HIDROFOBIK
Β -D-GLUKOSA
Wild-type -6,0 39,75 Thr110, Arg512, Asn514, His559,
FAD Trp426, Tyr515
E412C -5,9 47,06 Thr110, Arg512, Asn514, His559,
FAD Trp426, Tyr515
E412K -6,0 39,75 Thr110, Arg512, Asn514, His559,
FAD Trp426, Tyr515
E412W -6,1 33,57 Thr110, Arg512, Asn514, His559,
FAD Trp426, Tyr515
Kesimpulan
Berdasarkan hasil yang diperoleh dapat disimpulkan bahwa mutan E412C memberikan hasil positif yaitu meningkatan nilai Km enzim GOD-IPBCC sehingga mutasi ini dapat digunakan untuk meningkatkan efektifitas penggunaan enzim GOD-IPBCC sebagai enzymatic fuel cell.
Daftar Pustaka
Bobrowski, Tim, and Wolfgang Schuhmann. 2018. Long-Term Implantable Glucose Biosensors. Current Opinion in Electrochemistry 10: 112–19.
Bollella, Paolo, and Lo Gorton. 2018. Enzyme Based Amperometric Biosensors. Current Opinion in Electrochemistry 10: 157–73. Cruz, A G, W F Castro, J A F Faria, P C B Lollo, J
Amaya-Farfán, M Q Freitas, D Rodrigues, C A F Oliveira, and H T Godoy. 2012. Probiotic Yogurts Manufactured with Increased Glucose Oxidase Levels: Postacidification, Proteolytic Patterns, Survival of Probiotic Microorganisms, Production of Organic Acid and Aroma Compounds. Journal of Dairy Science 95 (5): 2261–69.
Dubey, Manish K, Andleeb Zehra, Mohd Aamir, Mukesh Meena, Laxmi Ahirwal, Siddhartha Singh, Shruti Shukla, Ram S Upadhyay, Ruben Bueno-Mari, and Vivek K Bajpai. 2017. Improvement Strategies, Cost Effective Production, and Potential Applications of Fungal Glucose Oxidase (GOD): Current Updates. Frontiers in Microbiology 8: 1032.
Ferri, Stefano, Katsuhiro Kojima, and Koji Sode.
2011. Review of Glucose Oxidases and Glucose Dehydrogenases: A Bird’s Eye View of Glucose Sensing Enzymes. J Diabetes Sci Technol 5 (5): 1068–76.
Gutierrez A, Erik, Anne-Maria Wallraf, Alexandra Balaceanu, Marco Bocola, Mehdi D Davari, Thomas Meier, Hartmut Duefel, and Ulrich Schwaneberg. 2018. How to Engineer Glucose Oxidase for Mediated Electron Transfer. Biotechnology and Bioengineering 115 (10): 2405–15.
Khanza, ADA. 2016. Karakterisasi Dan Kloning Gen Penyandi Glukosa Oksidase (GGOx) Dari Aspergillus Niger IPBCC 08.610. Institut Pertanian Bogor.
Leskovac, V, S Trivić, G Wohlfahrt, J Kandrač, and D Peričin. 2005. Glucose Oxidase from Aspergillus Niger: The Mechanism of Action with Molecular Oxygen, Quinones, and One-Electron Acceptors. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 37 (4): 731– 50.
Mano, Nicolas. 2019. Engineering Glucose Oxidase for Bioelectrochemical Applications. Bioelectrochemistry 128: 218–40.
Maulana, Farhan Azhwin, Laksmi Ambarsari, and Setyanto Tri Wahyudi. 2019. Homology Modeling and Structural Dynamics of the Glucose Oxidase. Indonesian Journal of Chemistry 20 (1): 43–53.
Nurlita, SD. 2017. Variasi Dimensi Elektroda Pasta Karbon Termodifikasi Polianilin Sebagai Biosensor Berbasis Glukosa Oksidase Aspergillus Niger IPBCC.08.610. Institut Pertanian Bogor.
Seminar Nasional Bioteknologi | 2020
77
Ostafe, Raluca, Nicolas Fontaine, David Frank, Matthieu Ng Fuk Chong, Radivoje Prodanovic, Rudy Pandjaitan, Bernard Offmann, Frédéric Cadet, and Rainer Fischer. 2020. One-Shot Optimization of Multiple Enzyme Parameters: Tailoring Glucose Oxidase for PH and Electron Mediators. Biotechnology and Bioengineering 117 (1): 17–29.
Reyes-De-Corcuera, José I, Hanna E Olstad, and Rosalía García-Torres. 2018. Stability and Stabilization of Enzyme Biosensors: The Key
to Successful Application and
Commercialization. Annual Review of Food Science and Technology 9: 293–322. Subiyono, Subiyono, M Atik Martsiningsih, and
Denni Gabrela. 2016. Gambaran Kadar Glukosa Darah Metode GOD-PAP (Glucose Oxsidase–Peroxidase Aminoantypirin) Sampel Serum Dan Plasma EDTA (Ethylen Diamin Terta Acetat). Jurnal Teknologi Laboratorium 5 (1): 45–48.
Triana R. 2013. Pemurnian Dan Karakterisasi
Enzim Glukosa Oksidase Dari Isolat Lokal Aspergillus Niger (IPBCC.08610). Institut Pertanian Bogor.
Tu, Tao, Yuan Wang, Huoqing Huang, Yaru Wang, Xiao Jiang, Zhenxing Wang, Bin Yao, and Huiying Luo. 2019. Improving the Thermostability and Catalytic Efficiency of Glucose Oxidase from Aspergillus Niger by Molecular Evolution. Food Chemistry 281: 163–70.
Vogt, Stephan, Marcel Schneider, Heiko Schäfer-Eberwein, and Gilbert Nöll. 2014. Determination of the PH Dependent Redox Potential of Glucose Oxidase by Spectroelectrochemistry. Analytical Chemistry 86 (15): 7530–35.
Wohlfahrt G, Witt S, Hendle J, Schomburg D, Kalisz HM, Hecht HJ. 1999. 1.8 and 1.9 Å Resolution Structures of the Penicillium Amagasakiense and Aspergillus Niger Glucose Oxidases as a Basis for Modelling Substrate Complexes. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr, 969–77.
Seminar Nasional Bioteknologi | 2020
78
Isolation and characterization of Rhizobium bacteria from various roots nodules legumes crops
Isolasi dan karakterisasi bakteri Rhizobium dari berbagai nodul akar tanaman legume Eka Lupitasari1*, Riki Ruhimat1, Sarah Sakinah Umadi2, Laudy Arrisa Arumsari Sahana1
1)Department of Soil Science and Land Resource, Faculty of Agriculture, Bogor Agricultural University, JL Meranti, Kampus IPB Darmaga, Bogor, 16680
2)Department of Agronomy and Horticulture, Faculty of Agriculture, Bogor Agricultural University, Jl Meranti, Kampus IPB Darmaga, Bogor, 16680
*)Corresponding author: ekalupitasarilupitasari@apps.ipb.ac.id
Abstract
A study was conducted to isolate and characterize Rhizobium from the roots nodules of soybean (Glycine max), peanuts (Arachis hypogaea) and Bambara beans (Vigna subterranea). The results showed total of 7 isolates were isolated from those various legume root nodules on YEMA + Congo red & YEMA + Bromtimol blue after 2 days of incubation. All isolates are morphologically characterized as round, slimy white with raised elevation, they were Gram negative bacteria. The results of biochemical tests showed 7 Rhizobium were able to survived with various pH, temperatures, and sanility ranges. These also reacted positively to the catalase, urease, oxidase, and carbohydrate fermentation tests, also lives in aerobic condition and able to move (motile). The results showed that the seven isolates that have been characterized have the potential to be developed as symbiotic N2-fixing biofertilizer.
[Keywords: biofertilizer, N2 fixation symbiotic, physiological character]
Introduction
The requirments of a few palawija commodity especially legume crops increased (Badan Pusat Statistik 2018). But recently occurred is nitrogen generally deficient in agriculture land. There are several important factors to increase availability of nitrogen which will affect productivity, one of the ways is improve the cultivation system by integrating with N2 fix biofertilizer. Legume crops can increase growth and yields through association with Rhizobium bacteria to fix N2 from atmosphere and change to ammonia (NO3) (Thilakaratna et al. 2019). N2 at the atmosphere cannot be directly absorbed by legume plants, they need role of Rhizobium bacteria which can symbiosis with root of legumes plants.
The role of Rhizobium in fixing N2 gas is very important and potentially develop to be biofertilizer. The mechanism of N2 fixation is by associating with root nodules has a significant advantage to growth and physiological properties
of plants (Thilakaratna et al. 2019). Rhizobium also contributed in several function such as dissolving phosphate, produce organic acids, produce growth hormones (ethylene, auxin, gibberellin) and as antibiotics (Qureshi et al. 2019; Ullah et al. 2017; Gopalakrishnan et al. 2015). Those functions showed that interaction between plants and Rhizobium in root nodul not only affect to yield but also played important roles as a PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria).
Production of biofertilizer use strain Rhizobium bacteria can be conduct through a several process such as exploration, isolation, and characterization. This study aims to isolate Rhizobium from root nodules of various legumes crops (Soybean, peanuts, and Bambara bean).
Material and Methods Place and date
This research was conducted at the Laboratory of Soil Biotechnology, Department of Soil Science and Land Resource, Faculty of