B. PENELITIAN UTAMA
4. ANALISIS EKSTRAK DARI BUAH SETENGAH
VANILLIN
a. TOTAL ASAM
Total asam adalah ukuran konsentrasi ion hidrogen yang terdispersi maupun yang tidak terdispersi. Prinsip analisis total asam
adalah banyaknya H+ yang bereakasi dengan OH- membentuk H2O (Harjadi, 1993).
H+ + OH- H 2O
Adanya asam organik dapat digunakan untuk identifikasi keaslian ekstrak panili karena asam-asam organik merupakan unsur yang terkandung dalam panili yang terbentuk selama proses curing. (Herman et al, 1990). Sebagian senyawa vanillin akan mengalami oksidasi enzimatik (enzim peroksidase) mengasilkan asam organik seperti asam benzoat dan asam vanillin. Senyawa golongan asam karboksilat juga dapat terbentuk dari reaksi oksidasi alkohol. Reaksi oksidasi alkohol dapat dilihat pada Gambar 17. Asam-asam organik seperti asam asetat, asam ferulat, dan asam malat juga dapat terbentuk dari hasil fermentasi glukosa yang ada dalam buah panili. Menurut Civolani et al (1999), asam ferulat dapat terbentuk melalui proses biokonversi dari asam vanillin oleh Pseudomonas flourescens. Menurut Purseglove et al (1981), ekstrak panili sedikitnya mengandung 20 asam organik. Berdasarkan hasil analisis GC-MS acetic acid adalah yang komponen asam yang paling dominan. Ekstrak panili dari buah panili setengah kering memiliki nilai total asam 380- 410 ml 0.1 N NaOH/l. Nilai ini sesuai dengan standar yang dibuat oleh FDA. Data nilai total asam dapat dilihat pada Lampiran 19.
Gambar 17. Reaksi oksidasi alkohol
b. LEAD NUMBER
Prinsip analisis lead number adalah asam organik dari panili diendapkan dengan Pb(CH3COO)2, garam Pb yang tidak larut dirubah,
[O]
RCH RCH2OH
dan kelebihan Pb ditentukan dengan titrasi chelometric dengan Na2EDTA. Menurut Harjadi (1993), EDTA merupakan asam berbasa empat. Bentuk sederhananya adalah H4Y. Sebagai asam lemah, EDTA mengalami pengionan bertahap melepaskan ion hidrogen satu per satu. EDTA mampu membentuk kompleks dengan ion logam dan memiliki konstanta ke stabilan yang besar sehingga reaksi berjalan sempurna. Pembentukan kelat logam dengan EDTA dapat ditulis secara umum sebagai berikut:
Mn+ + Y4- MYn-4
Lead number sering digunakan untuk menentukan asam organik dalam ekstrak secara cepat. Lead number ekstrak dari buah panili setengah kering adalah 4,5-4,6. Nilai lead number ini memenuhi persyaratan FDA yaitu sebesar 4.0-7.4. Lead number dan total asam adalah dua metode yang digunakan untuk mendeteksi adanya senyawa organik yang ada dalam ekstrak panili. Ekstrak panili alami mengandung senyawa organik yang terbentuk dari oksidasi senyawa vanillin selama proses curing dan dari hasil proses oksidasi alkohol selama proses conditioning. Kandungan senyawa organik yang rendah mengindikasikan adanya pencampuran. Data lead number dapat dilihat pada Lampiran 20.
Selain dengan uji lead number, kemurniaan ekstrak dapat diuji dengan menggunakan metode paper chromatography, ion exchange resin, dan thin -layer chromatrography. Namun, metode tersebut memiliki sensitivitas yang rendah, kesalahan eksperimen tinggi, dan memerlukan waktu yang lama. Metode lain yang dapat digunakan adalah Gas-liquid chromatography (GLC) dan High-performance liquid chromatography (HPLC). Metode analisis mass spectrometry (SIRA-MS) juga dapat digunakan untuk mendeteksi adulteration. Metode ini mengukur dan membandingkan isotop seperti karbon (13C/1 2C) antara ekstrak panili alami dan panili sintetik. Ekstrak panili alami memiliki karbon 13C yang lebih banyak dibandingkan ekstrak
panili sintetik yang dibuat dari lignin, eugenol atau guaiacol (Peter, 2004).
c. KADAR ABU
Abu berasal dari mineral-mineral yang dikandung dalam buah panili seperti kalium, kalsium, klor, dan magnesium. Kandungan mineral pada buah panili segar sekitar 0.02%. Kadar abu total ekstrak dari buah panili setengah kering adalah 1.33-3.34 g/l. Syarat minimal abu total yang ditetapkan oleh FDA adalah sebesar 2.20– 4.32 g/l. Ekstrak panili yang disaring dua kali memiliki kadar abu sebesar 1.33 g/l. Nilai ini lebih rendah dari persyarat FDA. Penyaringan dapat mempengaruhi perhitungan kadar abu karena sebagian senyawa anorganik yang tidak larut akan tertinggal dikertas saring whatman. Namun demikian, nilai ini 12 kali lebih besar jika dibandingkan dengan kadar abu ekstrak panili sintetik (0.1 g/l). Nilai abu total sangat penting untuk identifikasi kemurniaan ekstrak panili. Panili sintetik biasanya hanya mengandung vanillin atau etil vanillin. Panili sintetik biasanya hampir bebas dari abu. Data kadar abu dapat dilihat pada Lampiran 21.
d. ABU TERLARUT
Abu terlarut dihitung berdasarkan banyaknya abu yang larut dalam air panas. Abu terlarut ekstrak dari buah panili setengah kering adalah 0.8-2.9 g/l. Persyaratan FDA untuk abu terlarut adalah sebesar 1.79–3.57 g/l. Ekstrak yang memiliki nilai abu total rendah juga akan memiliki nilai abu terlarut rendah. Menurut Reineccius (1994) lebih dari 80% abu total larut di dalam air. Data abu terlarut dapat dilihat pada Lampiran 22.
e. ALKALINITAS ABU TERLARUT
Alkalinitas abu dinyatakan dalam ml 0.1 N asam/l. Nilai alkalinitas abu terlarut ekstrak dari buah setengah kering adalah 139.1- 216.5 ml 0.1 N HCl/l. Kedua nilai ini lebih kecil dari yang disyaratkan
oleh FDA yaitu 220– 400 ml 0.1 N asam/l. Data alkalinitas abu terlarut dapat dilihat pada Lampiran 23.
f. ALKALINITAS ABU TOTAL
Alkalinitas abu total dihitung berdasarkan alkalinitas abu terlarut dan alkalinitas abu tidak terlarut. Nilai alkalinitas abu total ekstrak dari buah panili setengah kering adalah 462.6-536.7 ml 0.1 N HCl/l. Alkalinitas menunjukan adanya unsur logam yang dapat membentuk basa seperti natrium, kalium, kalsium dan magnesium. Unsur-unsur logam ini berasal dari unsur mineral yang ada di dalam buah panili. Alkalinitas merupakan pertahanan larutan terhadap keasaman. Oleh karena itu, alkalinitas akan berhubungan dengan pH ekstrak, nilai total asam dan lead number. Data alkalinitas abu total dapat dilihat pada Lampiran 23.
Perbandingan karakteristik ekstrak dari buah setengah kering, kontrol (ekstrak dari buah kering yang dikeringkan dengan metode Balitro II tanpa penambahan sukrosa dan gliserin), dan standar FDA dapat dilihat pada Tabel 14.
Tabel 14. Perbandingan karakteristik ekstrak Karakteristik Ekstrak dari buah
setengah kering Kontrol Standar FDA Kadar vanilli (g/l) 3.7-4.5 3.2 1.1-3.5 Abu (g/l) 1.3-3.4 3.8 2.2-4.32 Abu terlarut (g/l) 0.8-2.9 3.2 1.79-3.57 Alkalinitas abu total
(ml 0.1 N asam/l)
462.6-536.7 487.3 300-540 Alkalinitas abu terlarut
(ml 0.1 N asam/l) 139.1-216.5 277.1 220-400 Total asam (ml 0.1 NaOH/l) 380-410 600 300-520 Lead number 4.5-4.6 4.9 4-7.4
g. ANALISIS SENYAWA VOLATIL
Analisis senyawa volatil dilakukan dengan menggunakan GC- MS. Senyawa volatil yang terdeteksi dapat dilihat pada Tabel 15.
Tabel 15. Analisis senyawa volatil Luas Area Nama RT Kontrol S1 S2 Rata-rata S1,S2 Aroma Aliphatic acids
Formic acid 3.022 301248 1988638 1711099 1849869 Pungent
Acetic acid 3.251 2726508 5407973 5953784 5680879 Sour, vinegar, pungent
Oxalic acid 4.936 38162 38162 Pungnt 3-hydroxy butanoic acid 7.275 39020 39020 Rancid Fatty acid
Decanoic acid 40.740 39466 Oily/fatty Aliphatic alcohols
2-propyn-1-ol 4.118 109487
2,3-butanediol 4.611 50367 Floral, oily 1-acetoxy-2-propanol 5.382 15820 29965 22893
2-furanmenthol 5.567 62459 192843 280413 236628
Furaneol 11.683 23698 23698 Fruit, burnt, sugar Maltol 12.494 392493 397882 395188 Cotton candy, sweet Aliphatic esters and lactones
Methyl acrylate 4.313 291343 291343 Methyl glycoate 4.033 109256 109256 Methyl pyruvate 4.821 380012 878139 629076 2-acetyl—2-hydroxy- gamma butyrolactone 14.114 116092 161158 282774 221966 Coconut-like Alkanes Hexadecanal 33.648 146633 146633 Green Aromatic ethers
Methyl- d31-dideuterio -2-propenyl ether
3.595 70966 127546 237528 182537 Propyl isopropyl ether 4.486 103864
Methyl vanillylether 23.324 149902 208097 179000 Aromatic ketones 1-hydroxy-2-propanone 3.461 771428 4256057 2940313 3598185 3-hydroxy-2-butanone 4.108 22810 282480 152645 Buttery 1-penten-3-one 4.467 220608 220608 1-hydroxy-2-propanone 4.282 187347 2,3-pentadione 4.473 161584 161584 Sweet 1-hydroxy-2-butanone 4.621 185151 185151 1-(acetyloxy)-2-propanone 6.046 13009 13009 Dihydro-2(3H)-furanone 6.821 28282 64303 64303 Caprolactone 7.051 64162 64162 2-hydroxycyclopent-2-en-1-one 7.390 162745 162745 Cyclohexanone 7.152 93603 5-methyl-2(3H)-furanone 7.299 16049 1-(acetyloxy)-2-propanone 8.475 8966 2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6- methyl-4H-pyran-4-one 14.354 565627 935386 1528709 1232048 2-pentadecanone 33.132 138938 138938 Buttary Aromatic aldehydes Benzaldehyde 22.670 21370 Vanilla-like, Vanillin 23.520 2693470 5320194 6095183 5707689 Vanilla, sweet Heterocyclics Furfural 4.733 254094 5-(hydroxymethyl)-2-furfural 17.890 2334317 7369951 Aliphatic hydrocarbon 1,1-diethoxyethane 4.808 72354 72354 2,4-dimethy-1,3-dioxane 8.630 115557 78113 78113 3-hydroxy tetrahydrofuran 9.694 756808 756808
n-pentanal 12.521 147854 434405 434405 Green, oily BHT 31.872 100040 209152 154596
Pada ekstrak yang diperoleh dari buah panili hasil pengeringan metode Balitro II (kontrol) diperoleh 17 puncak. Sedangkan pada ekstrak dari buah setengah kering ulangan 1 diperoleh 28 puncak dan dari ulangan 2 diperoleh 24 puncak. Senyawa yang terdeteksi pada kontrol tetapi tidak terdeteksi pada ekstrak dari buah panili setengah kering adalah 2 -propyn-ol, 1-hydroxy -2-propanone, 2,3 butanediol, propyl isopropyl ether, dan cyclohexanone. Sedangkan senyawa yang terdeteksi pada ekstrak buah panili setengah kering tetapi tidak terdeteksi pada kontrol adalah 3-hidroxy-2-butanone, methyl acrylate, methyl glycolate, methyl pyruvate, 1-penten-3-one, 2,3 pentadione, 1- hydroxy-2-butanone, furfural, 1,1-diethoxyethene, oxalic acid, 1- acetoxy-2 -propanol, 1-(acetyloxy)-2-propanone, caprolacton, 2- hydroxycyclopent-2 -en-1-one, 3-hydroxy butanoic acid, 5-methyl- 2(3H) -furanone, 1-(acetyloxy)-2-propanone, 3-hydroxy tetrahydrofuran, furaneol, maltol, 5-(hydroxymethyl)-2 -furfural, methyl vanillyether, 2-pentadecanone, hexadecanal, dan decanoic acid. Senyawa golongan heterosiklik seperti furfural dan 5- (hydroxymethyl)-2-furfural yang terdapat pada ekstrak buah panili setengah kering diduga berasal dari hasil reaksi maillard. Reaksi ini dapat terjadi karena pada saat proses ekstraksi ditambahkan sukrosa. Komponen flavor yang terbentuk dari reaksi maillard dapat dilihat pada Gambar 18.
Luas area vanillin pada ekstrak dari buah panili setengah kering 1.9-2.3 kali lebih besar dibandingkan luas area vanillin kontrol. Senyawa vanillin pada konsentrasi 19118 ppm memiliki aroma panili dan sweet. Asam asetat pada konsentrasi 124 ppm memiliki aroma sour dan vinegar. n-heptanal pada konsentrasi 2.1 ppm memiliki aroma green dan oily. Sedangkan 3-hidroksi-2-butanon pada konsentrasi 14.6 ppm memiliki aroma buttery (Silva et al, 2005). Komponen flavor seperti vanillin dan guaiacol dapat dibentuk dari asam ferulat oleh bakteri dan jamur yang aktif di dalam dinding sel (Rolling, 2002).
Reducing sugar and α-amino acid (Maillard Reaction)
N-glycosylamines or N-fruktosylamines Furfural
1-amino-1-deoxy-2-ketose or 1-amino-2-deoxy-2-aldos (Amadori and Heyns intermediates)
Reduction and dehydroreduction Hydroxymethyl-5-furfural
3-furanones Hydroxyacetone Glyoxal Aldehides + α-aminoketones
4-pyranones Cyclotene Pyruvaldehyde (+ methianal from methionine) Pyrroles Dihydroxyacetone Glycolaldehyde ( + H2S and NH3 from cystein) Thiophenes Hidroxyacetyl Glyceraldehyde
Acetan
Heterocyclization Pyridines Thiazoles
Pyrazine Pyroles Oxazoles Imidazoles Gambar 18. Pembentukan komponen flavor melalui nonenzimatik browning