commit to user
TINJAUAN PUSTAKA DAN KERANGKA KONSEP PENELITIAN
2.3 Analisis Isozim
Isozim pertama kali dideskripsikan oleh RL. Hunter dan Clement Market pada tahun 1957 yang didefinisikan sebagai berbagai varian yang sama enzim yang memiliki fungsi yang sama dan hadir dalam individu yang sama (Houghton, 2007). Definisi mencakup (1) varian yang berbeda dari produk gen sehingga mewakili berbagai loci (digambarkan sebagai isozim) dan (2) enzim yang berbeda dari produk yang sama allel gen (digambarkan sebagai allozim).
commit to user
Isozim adalah enzim yang merupakan produk langsung dari gen, terdiri dari berbagai molekul aktif yang mempunyai struktur kimia berbeda tetapi mengkatalis reaksi yang sama. Enzim merupakan protein biokatalisator untuk proses – proses fisiologis tanaman yang pengadaan dan pengaturannya dikontrol secara genetik (Shannon, 1968 dalam Cahyarini 2004).
Penggunaan penanda isozim mempunyai kelebihan karena isozim diatur oleh gen tunggal dan bersifat kodominan dalam pewarisan, bersegresi secara normal menurut nisbah Mendell, kolinier dengan gen dan merupakan produk langsung gen, penanda ini bersifat stabil karena tidak dipengaruhi oleh faktor lingkungan, lebih cepat dan akurat berproduksi (Sudiarto dan Sukmadjaja, 2001).
Isozim memiliki beberapa karakteristik dan keuntungan, antara lain : 1) Produk dari alel yang berbeda bergerak pada posisi yang berbeda dalam gel, 2) Alel yang berbeda biasanya diwariskan secara kodominan, bebas dari epistasis, sehingga individu homozigot dapat dibedakan dari heterozigot, 3) Seringkali posisi pita merupakan produk dari suatu lokus, sehingga memungkinkan untuk mendeteksi jumlah gen yang mengkode suatu enzim dengan menganalisis pola pita dari enzim tersebut, 4) Peralatan dan bahan yang diperlukan relatif tidak terlalu mahal dan percobaan dapat dilakukan dengan mudah di labotarium, 5) Jumlah sampel yang banyak dapat dianalisis dengan waktu singkat, dan 6) Dapat dilakukan pada fase bibit, sehingga dapat menghemat, tempat maupun waktu ( Hadiati , 2002 )
commit to user
Analisis isozim merupakan metode yang ekonomis dan efektif untuk mengetahui terjadinya rekombinai gen dan kromoson. Isozim digunakan sebagai marker genetik untuk mengamati rekombinasi dan segregasi karakter kualitatif dan kuantitatif. Analisis isozim merupakan metode yang efisien untuk mengetahui genetik tanaman dalam pelestarian sumber alam dan pengelolaannya (Karcicio, 2003). Chen et al (2006) mengatakan bahwa beberapa peneliti juga menggunakan data isozim untuk mengukur jarak genetik, keragaman geenetik, sistematik, mengkonfirmasi hybrid, dan finger printing kultivar.
Isozim adalah bentuk – bentuk enzim yang berbeda secara fisik dapat dipisahkan, terdapat dalam berbagai tipe sel atau kompartemen sub seluler . Isozim lazim ditemukan didalam serum dan jaringan semua vertebrata, insekta, tumbuhan dan organism uniseluler Jenis dan jumlah enzim pada masing – masing organism berbeda – beda. Jaringan yang berbeda juga dapat mengandung isozim yang berbeda, dan semua isozim mempunyai afinitas yang berbeda – beda terhadap substrat (Murray, 1999).
Fungsi utama isozim adalah sebagai konrtrol dalam aktivitas metabolism didalam sel. Frekkuensi perbedaan isozim ada pada organela yang berbeda pada sel tumbuhan (Goodwin, 1983). Isozim dapat digunakan sebagai penanda genetik untuk mempelajari keanekaragaman antar individu dalam satu populasi serta mengidentifikasi varietas dan hibridanya (Hunter, 1981).
commit to user
Penggunaan pola pita isozim merupakan salah satu pendekatan untuk mengetahui jarak genetik dan hubungan kekerabatan tanaman. Hal ini dilakukan oleh Cahyarini (2004) pada penelitiannya terhadap beberapa varietas lokal kedele di Jawa, sedangkan Vihara (2005) pada tanaman duku. Analisis izosim juga digunakan untuk mengkarakterisasi struktur genetik kultivar Solanum tuberosum ssp. Andigena (Huaman, 2000).
Analisa isozim berguna untuk identifikasi dan mengkarakterisasi tanaman yang harus diketahui terlebih dahulu untuk penelitian. Contohnya, untuk mempelajari pengaruh suhu terhadap pembungaan. Untuk identifikasi tanaman yang lebih jelas dilakukan analisis isozim (Degani at al 1986).
Identifikasi kultivar dengan memanfaatkan data analisis isozim membuktikan dapat konsisten atau sama dengan identifikasi secara morfologi, dan sebaik penanda fiisiologinya. Meskipun penanda morfologi dan fisiologi dapat untuk identifikasi kultivar, namun dipertimbangkan analisis isozim adalah esensial ketika penanda morfologi dan fisiologi tidak cukup / kurang memadai. Terlebih lagi isozim dimana produk gen langsung dan secara relatif tidak dipengaruhi oleh lingkungan, sehingga hal itu lebih cocok daripada penanda morfologi saja (Degani at al , 1986).
Peroksidase (PRX) adalah enzim oksidoreduktase, yang berperan untuk oksidfasi substrat sambil mereduksi H2O2 menjadi H2O. Rothe (1994) mengatakan bahwa isozim peroksidase tersebar luas khususnya pada tanaman dan terdapat dalam jumlah banyak, dengan
commit to user
adanya hydrogen peroksida (H2O2) mengkatalisa oksidasi fenol (AH2) dan aromatic amines (AH2) sesuai reaksi berikut :
Enzim-H2O2 + AH2 enzim + A +2H2O
Aktivitas isozim peroksidase mudah dideteksi karena ktivitasnya yang luar biasa pada jaringan. Bahkan isozim peroksidase masih dapat dideteksi tanaman padi berumur 110 hari setelah sebar (Ito, 1991). Bahan yang dapat digunakan untuk analisis ini antara lain akar, batang, daun atau bijinya. Analisis isozim peroksidase telah digunakan oleh beberapa peneliti dalam pengujian terhadap beberapa tanaman antara lain: padi (Ito, 1991) ; jeruk besar (Purwanto, dkk., 2002) ; Ranunculus (Suranto, 2001) ; Ananas comosus (L.) Merr. (Hadiati, 2003); kedelai (Cahyarini, 2004); Lansium dometicum Coor (Vihara, 2005); Ttribus alpianae (Lestari, 2005).
Esterase (EST) pada tanaman merupakan enzim hidrolitik yang berfungsi melakukan pemotongan ester sederhana pada asam organik, asam anorganik alkohol dan fenol serta mempunyai berat molekul rendah dan mudah larut (Subronto, 1986 dalam Cahyarini, 2004). Bahan yang dapat digunakan untuk analisis isozim esterase antara lain akar, batang atau daunnya. Para peneliti juga telah banyak menggunakan analisis isozim esterase untuk mengkaji sifat genetik makhluk hidup antara lain dilakukan pada: padi (Iskandar, 1992); manggis (Mansyah, 1999); Ranunculus (Suranto,2001); jeruk besar (Purwanto, 2002); Achatina varigata (Novianto, 2004); kedelai (Cahyarini,2004); Lansium domesticum Coo; (Vihara, 2005); Tribus alpinae (Lestari, 2005). Tehnik percobaan
commit to user
secara modern pada taksonomi tanaman sekarang dipercayai mempunyai akurasiyang lebih tepat dari pada taksonomi klasik /ortodok dalam pengelompokan / klasifikasi. Data yang digunakan tidak hanya berdasarkan dari karakter morfologi, tetapi bukti tambahan lain seperti serbuk sari dan kromosom juga diambil untuk pertimbangan, sebab kenyataannya mereka menyediakan kontribusi besar dalam membantu para ahli taksonomi. beberapa pekerjaan taksonomi pada waktu sekarang menjadi lebih signifikan maju setelah diterapkan teknik elektroforesis ( Suranto, 2002 ). Teknik elektroforesis ini dapat digunakan untuk analisis isozim. Elektroforesis memiliki peran yang penting dalam evaluasi secara kuantitatif dan pengelolaan sumber genetik ( Karcicio , 2003 )
Elektroforesis adalah suatu cara pemisahan dalam suatu larutan atas dasar proses perpindahan partikel – partikel bermuatan karena pengaruh medan listrik. Molekul – molekul biologis yanga bermuatan listrik dalam larutan akan bergerak kearah elektrode yang polaritasnya berlawanan dengan muatan molekul. Pemisahan degan molekul – molekul dengan muatan yang berbeda merupakan prinsip yang digunakan dalam elektroforesis ( Nur dan Adijuwana 1997 ).
Isozim dapat dipisahkan dengan menggunakan metode elektroforesis dan hasilnya berupa zimogram pola pita. Zimogram hasil elektoforesis bercorak khas sehingga dapat digunakan sebagai ciri fenotipe untuk mencerminkan pembeda genetik.
Pada elektoforesis, gel sangat cocok dan digunakan secara luas untuk tujuan taksonomi tanaman. Pada umumnya gel yang sering
commit to user
digunakan adalah pati dan poliakrilamid. Sistem gel elektroforesis, berhasil digunakan untuk memisahkan protein. Gel pati sebagai media elektroforesis mempunyai kelebihan pada resolusi komponen serum 20 – 25 dapat diakui sebagai perbandingan terhadap 5 – 6 komponen dengan metode konvensional. Kemudian teknik – teknik pada tahun – tahun terakhir sangat diuntungkan dengan dikenalkannya gel poliakrilamid, yang digunakan dengan metode khusus untuk elektroforesis. Gel poliakrilamid adalah media terbaik untuk memisahkan pita – pita protein dalam jumlah besar dan paling jelas dari pada selulosa asetat untuk kertas. Persentase poliakrilamid dalam media elektroforesis yang sering digunakan adalah 7% biasanya dalam buffer tris – glisin pada pH 8,1. Pada kasus - kasus tertentu, perbandingan antara poliakrilamid dan pH bervariasi. Poliakrilamid menarik para taksonomis yang tertarik dengan protein terhadap kemotaksonomi menggunakan elektroforesis, dan elektroforesis mencakup bidang yan luas pada tanaman tingkat tinggi ( Suranto, 2002 ).
Gel poliakrilamid digunakan untuk elektroforesis dengan enam sistem enzim yaitu PRX (peroksidase) PGM (phosphoglucomutase), ADH (alcohol), MDH (malate dehidrogenase), SKDH (shikimatedehydrogenase), GPI (glucose phosphateisomerase) (Hadiati, 2002).
Pemilihan bahan yang akan digunakan dalam elektroforesis merupakan hal yang sangat penting. Isozim tertentu dijumpai pada jaringan khusus, seperti pada bagian tertentu dari sel, atau mungkin pada tingkat perkembangan yang dari siklus hidup tanaman. Dari alasan tersebut maka pemilihan tipe jaringan dan tingkat perkembangan tanaman yang sama studi isozim merupakan hal perlu diperhatikan. Sebagai contoh yang
commit to user
digunakan adalah daun – daun yang diperkirakan berukuran (dimensi) sama, posisi sama pada batang atau tangkai, dan diambil ketika fase pertumbuhan yang sama pada musim tersebut (Concle, 1982).
Daun adalah jaringan yang paling tepat untuk analisis isozim. Meskipun jaringan lain seperti kotiledon, batang muda, daun tua dan jaringan buah dapat digunakan. (Arulsekar, 1982).