HILDA RAFIKA WATY C3408
2 TINJAUAN PUSTAKA
3.4 Analisis Sampel Penelitian
3.4.1 Analisis kadar air (AOAC 2005)
Analisis kadar air dilakukan dengan penguapan menggunakan oven. Tahap awal yang dilakukan adalah proses pengeringan cawan porselen dengan menggunakan suhu 102-105 oC selama 1 jam. Cawan tersebut diletakkan dalam desikator kurang lebih 15 menit hingga dingin kemudian ditimbang. Sampel
sebanyak 5 gram dimasukan ke dalam cawan kemudian dikeringkan dengan suhu 102-105 oC selama 6 jam. Setelah 6 jam cawan tersebut dimasukkan ke dalam desikator hingga dingin kemudian ditimbang bobotnya.
Perhitungan kadar air:
% Kadar air = B - C x 100% B – A
Keterangan: A = Berat cawan kosong (gram)
B = Berat cawan yang diisi sampel (gram) sebelum dioven C = Berat cawan dengan sampel (gram) setelah dioven 3.4.2 Analisis kadar abu (AOAC 2005)
Analisis kadar abu dilakukan dengan mengabukan sampel di dalam tanur. Tahap pertama cawan abu porselen dikeringkan di dalam oven selama 1 jam pada suhu 105 oC, lalu didinginkan dalam desikator kemudian ditimbang. Sampel ditimbang sebanyak 5 gram dan dimasukkan ke dalam cawan pengabuan yang akan dipijarkan di atas nyala api bunsen hingga tidak berasap lagi. Setelah itu dimasukkan ke dalam tanur pengabuan dengan suhu 600 oC selama 6 jam, kemudian ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan. Proses pengabuan dilakukan sampai abu berwarna putih. Setelah itu cawan didinginkan dalam desikator selam 30 menit, kemudian ditimbang bobotnya.
Perhitungan kadar abu:
% kadar abu = C - A x 100% B – A
Keterangan: A = Berat cawan kosong (gram)
B = Berat cawan yang diisi sampel (gram) sebelum ditanur C = Berat cawan dengan sampel (gram) setelah ditanur 3.4.3 Analisis kadar nitrogen (AOAC 2005)
Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap, yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi. Pengukuran kadar protein dilakukan dengan metode mikro Kjeldahl. Sampel ditimbang sebanyak 0,25 gram, kemudian dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl 100 mL, lalu ditambahkan 0,25 gram selenium dan 3 mL H2SO4 pekat. Contoh didestruksi pada suhu 410 oC selama kurang lebih 1 jam sampai larutan jernih lalu didinginkan. Setelah dingin, ke dalam labu Kjeldahl ditambahkan 50 mL akuades dan 20 mL NaOH 40 %,
kemudian dilakukan proses destilasi dengan suhu destilator 100 oC. Hasil destilasi ditampung dalam labu Erlenmeyer 125 mL yang berisi campuran 10 mL asam borat (H3BO3) 2 % dan 2 tetes indikator bromcherosol green-methyl red yang berwarna merah muda. Setelah volume destilat mencapai 40 mL dan berwarna hijau kebiruan, maka proses destilasi dihentikan. Lalu destilat dititrasi dengan HCl 0,1 N sampai terjadi perubahan warna merah muda. Volume titran dibaca dan dicatat. Larutan blanko dianalisis seperti contoh.
Kadar nitrogen dihitung dengan rumus sebagai berikut :
% N = (mL HCl – mL blanko) x N HCl x 14,007 x faktor pengenceran x 100% mg contoh x faktor koreksi alat *
*) Faktor koreksi alat = 2,5 *) Kadar protein = %N x 6.25 *) Faktor pengenceran= 10
3.4.4 Analisis pengukuran derajat deasetilasi (Domszy dan Robert 1985)
Kitosan sebanyak 0,2 gram digerus dengan KBr dalam mortar sampai homogen, kemudian dimasukkan dalam cetakan pelet, dicetak dengan dipadatkan dan divakum sampai optimum. Selanjutnya pelet ditempatkan dalam sel dan dimasukkan ke dalam tempat sel pada spektrofotometer inframerah IR-408 yang sudah dinyalakan dan stabil kemudian dilakukan penekanan tombol pendeteksian, sehingga akan muncul histogram FTIR pada rekorder yang memunculkan puncak- puncak dari gugus fungsi yang terdapat pada sampel kitosan. Histogram yang diperoleh dapat digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif misalnya analisis kuantitatif derajat deasetilasi dari kitosan.
Pengukuran derajat deasetilasi berdasarkan kurva yang tergambar oleh spektrofotometer. Puncak tertinggi (P0) dan puncak terendah (P) dicatat dan diukur dengan garis dasar yang dipilih. Nisbah absorbansi dihitung dengan rumus:
Keterangan:
P0 = Jarak antara garis dasar dengan garis singgung antara dua puncak tertinggi dengan panjang gelombang 1.655 cm-1 atau 3.450 cm-1.
A = Log P0 P
P = Jarak antara garis dasar dengan lembah terendah dengan panjang gelombang 1.655 cm-1 atau 3.450 cm-1.
Perbandingan absorbansi pada 1.655 cm-1 dengan absorbansi 3.450 cm-1 digandakan satu per standar N-deasetilasi kitosan (1,33). Dengan mengukur absorbansi pada puncak yang berhubungan, nilai persen N-deasetilasi dapat dihitung dengan rumus:
Keterangan: A1.655 = Absorbansi pada panjang gelombang 1.655 cm-1. A3.450 = Absorbansi pada panjang gelombang 3.450 cm-1.
1,33 = konstanta untuk derajat deasetilasi yang sempurna.
3.4.5 Analisis pengujian antibakteri kitosan (Lalitha 2004).
Uji ini meliputi persiapan media cair, persiapan media padat dan prosedur aktivitas antibakteri. Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dnegan metode difusi agar (Kirby bauer) menggunakan kertas cakram (paper disc).
a. Persiapan media cair
Penyegaran bakteri uji (refresh bakteri) yaitu menggunakan media NB (nutrient broth). NB (Oxoid) ditimbang sebanyak 0,72 gram lalu dilarutkan ke dalam 60 ml akuades, media tsb dihomogenkan menggunakan hotplate pada suhu 100oC. Media yang telah homogen dimasukkan sebanyak 9 ml ke dalam tabung reaksi dan masing-masing tabung ditutup menggunakan kapas dan aluminium foil. Media tersebut disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit. Media didinginkan di tempat yang steril pada suhu ruang.
b. Persiapan media padat
Media padat yang digunakan adalah MHA (muller hinton agar ). Media MHA dibuat dengan cara melarutkan 38 % MHA ke dalam akuades. Larutan tersebut dihomogenkan menggunakan hotplate pada suhu 100oC. Larutan kemudian dipipet 20 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan masing- masing tabung ditutup menggunakan kapas dan alumunium foil. Media tersebut disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit. Media didiamkan
dalam laminar aseptik sampai agar beku. Apabila media sudah beku, media disimpan dalam refrigerator.
c. Persiapan suspensi bakteri
Sebanyak satu ose bakteri uji dimasukkan ke dalam media cair NB yang telah dingin secara aseptik, kemudian diinkubasi pada suhu 37oC (18-24 jam). Biakan bakteri yang telah diinkubasi tersebut diukur rapat optis atau OD (optical density) nya dengan nilai antara 0,5-0,8 pada panjang gelombang 600 nm.
d. Pengujian antibakteri
Tahap pertama pada uji aktivitas antibakteri ini adalah meneteskan larutan kitosan dengan konsentrasi 0,5 %, 1,0 %, dan 1,5 % pada setiap paper disc sebanyak 20 mikroliter sehingga didapat konsentrasi larutan kitosan per paper disc dengan menggunakan pipet mikro. Paper disc yang telah berisi larutan kitosan dibiarkan sampai mengering atau pelarutnya menguap dalam laminar steril.
Tahap selanjutnya, sebanyak 20 ml media MHA dalam keadan cair ditambahkan 20 mikroliter bakteri uji yang telah diukur OD menggunakan pipet mikro. Media agar yang telah ditambahkan bakteri uji dihomogenkan dengan vortex, kemudian segera dituangkan ke dalam cawan petri steril dan digoyangkan membentuk angka delapan agar bakeri menyebar dan media MHA tercampur merata. Media agar terebut didiamkan dalam laminar aseptik selama 15 menit atau sampai agar beku.
Apabila media MHA tersebut telah membeku, masing-masing paper disc diletakkan dalam cawan petri berisi agar dan bakteri dengan menggunakan pinset steril. Cawan tersebut kemudian diinkubasi dalam keadaan terbalik dalam waktu 18-20 jam dengan suhu 37oC. aktivitas antibakteri dapat dilihat dengan mengamati zona hambatan yang terbentuk di sekeliling paper disc. Antibakteri dikatakan positif jika terbentuk zona hambatan berupa zona bening di sekeliling paper disc dan antibakteri negatif ditandai dengan tidak terbentuknya zona bening. Diameter zona hambat yang terbentuk diukur lebarnya menggunakan penggaris atau jangka sorong. Besar diameter zona hambat dihitung dengan cara mengurangi diameter zona hambat yang terbentuk pada cawan petri uji dengan diameter paper disc.