Bahan Genetik
Materi tanaman yang digunakan adalah 45 galur jagung manis (Tabel 3), merupakan galur hasil persilangan backcross ke empat (BC4F4) antara jagung manis dengan galur Mr4, Mr11, Mr12, dan Mr14.
Tabel 3 Materi tanaman yang digunakan dalam penelitian
No Materi genetik No No Materi genetik 1 Mr4/SC/BC4-1-1B 16 Mr11/SC/BC4-1-1B 31 Mr12/SC/BC4-3-1B 2 Mr4/SC/BC4-2-1B 17 Mr11/SC/BC4-1-2B 32 Mr12/SC/BC4-3-2B 3 Mr4/SC/BC4-2-2B 18 Mr11/SC/BC4-2-1B 33 Mr12/SC/BC4-4-1B 4 Mr4/SC/BC4-2-3B 19 Mr11/SC/BC4-3-1B 34 Mr12/SC/BC4-4-2B 5 Mr4/SC/BC4-3-1B 20 Mr11/SC/BC4-3-2B 35 Mr12/SC/BC4-5-B 6 Mr4/SC/BC4-4-1B 21 Mr11/SC/BC4-4-1B 36 Mr12/SC/BC4-5-2B 7 Mr4/SC/BC4-5-1B 22 Mr11/SC/BC4-6-1B 37 Mr12/SC/BC4-5-3B 8 Mr4/SC/BC4-6-1B 23 Mr11/SC/BC4-6-2B 38 Mr12/SC/BC4-6-1B 9 Mr4/SC/BC4-6-2B 24 Mr11/SC/BC4-7-1B 39 Mr12/SC/BC4-6-2B 10 Mr4/SC/BC4-6-3B 25 Mr11/SC/BC4-7-2B 40 Mr12/SC/BC4-7-1B 11 Mr4/SC/BC4-7-1B 26 Mr11/SC/BC4-8-1B 41 Mr12/SC/BC4-8-2B 12 Mr4/SC/BC4-8-1B 27 Mr11/SC/BC4-8-2B 42 Mr12/SC/BC3-1-1B 13 Mr4/SC/BC4-8-2B 28 Mr12/SC/BC4-1-1B 43 Mr12/SC/BC3-1-2B 14 Mr4/SC/BC4-8-3B 29 Mr12/SC/BC4-1-2B 44 Mr12/SC/BC3-3-1B 15 Mr4/SC/BC3-8-2B 30 Mr12/SC/BC4-2-1B 45 Mr12/SC/BC3-3-2B
27 Percobaan di Laboratorium
Pelaksanaan
Biji ditanam sebanyak 10 individu untuk masing-masing galur pada baki yang menggunakan media tanah. Proses isolasi, amplifikasi, dan visualisasi pola pita DNA mengikuti prosedur George et al. (2004) dengan beberapa modifikasi. Materi tanaman yang digunakan untuk ekstraksi DNA adalah tanaman yang berumur 10 sampai 15 hari setelah tanam.
Isolasi DNA
Bagian tanaman yang diambil adalah daun muda yang telah membuka sempurna sebanyak 5 - 8 individu tanaman dipotong-potong kecil, dicampur kemudian ditimbang 0,4 g per sampel. Sampel daun tersebut diisolasi DNAnya dengan bantuan buffer (0,7 ml per sampel) di laboratorium, masing-masing sampel digerus menggunakan mortal sampai halus dan dimasukkan ke dalam tabung ependorf berukuran 2,0 ml, ditambahkan 0,5 ml buffer ektraksi CTAB panas yang mengandung -mercaptoethanol konsentrasi 2 l/ml larutan kemudian diinkubasi pada suhu 65o C dalam waterbath dan didinginkan ±30 menit.
Amplifikasi dan Visualisasi Pola Pita DNA
Primer mikrosatelit yang digunakan sebanyak 20 primer (forward dan reverse), diperoleh dari Research Genetik, Inc, dan dari Invitrogen. Primer-primer tersebut diseleksi berdasarkan tingkat polimorfisme (referensi dari CIMMYT) (Tabel 4).
Proses amplifikasi, pemisahan DNA pada PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis), juga mengikuti prosedur George et al. (2004) dengan beberapa modifikasi. Modifikasi dilakukan sesuai dengan kondisi laboratorium karena penggunaan enzim dari sumber yang berbeda dan juga untuk efisiensi penggunaan bahan tanpa mengurangi kualitas visualisasi DNA. Inbrida yang menghasilkan tingkat heterosigositas >20% dan missing data >15% dikeluarkan. Denaturasi poliakrilamid gel elektroforesis dengan 4.5% akrilamid menggunakan sistem sequigen 38x40 cm dan protokol Bio-Rad Laboratories Inc. Hercules, CA, USA. Pita-pita DNA dideteksi melalui proses silver staining menggunakan protokol sistem sekuensing DNA Promega Silver Sequence.
28 Pengamatan Data Molekuler
Analisis data molekuler dilakukan berdasarkan hasil skoring pita DNA yang muncul pada plate. Pita DNA diberi skor berdasarkan penampilan pita DNA ditransformasi ke dalam kode data biner dengan cara: jika ada pita diberi skor satu (1) dan jika tidak ada pita diberi skoring nol (0). Pita yang tidak sempurna dan tidak jelas diberi skor 9 (missing data). Jika ada galur yang menghasilkan banyak pita maka pita yang paling jelas diberi skor ‘1’ sedangkan yang lainnya diberi skor ‘9’.
Data pada kolom menunjukkan inbrida sedangkan baris menunjukkan lokus SSRs. Tabel 4 Sekuen dari 20 marka mikrosatelit yang digunakan dalam penelitian
No. Primer Bin No. Repeat
type Primer Sequence
1 phi109275 1.03 AGCT CGGTTCATGCTAGCTCTGC // GTTGTGGCTGTGGTGGTG 2 phi96100 2.01 ACCT AGGAGGACCCCAACTCCTG // TTGCACGAGCCATCGTAT 3 phi374118 3.02 ACC TACCCGGACATGGTTGAGC // TGAAGGGTGTCCTTCCGAT
4 phi079 4.05 AGATG TGGTGCTCGTTGCCAAATCTACGA // GCAGTGGTGGTTTCGAACAGACAA 5 phi109188 5.03 AAAG AAGCTCAGAAGCCGGAGC // GGTCATCAAGCTCTCTGATCG
6 phi299852 6.07 AGC GATGTGGGTGCTACGAGCC // AGATCTCGGAGCTCGGCTA 7 phi328175 7.04 AGG GGGAAGTGCTCCTTGCAG // CGGTAGGTGAACGCGGTA 8 phi233376 8.09 CCG CCGGCAGTCGATTACTCC // CGAGACCAAGAGAACCCTCA
9 phi065 9.03 CACTT AGGGACAAATACGTGGAGACACAG // CGATCTGCACAAAGTGGAGTAGTC 10 umc1196 10.07 CACACG CGTGCTACTACTGCTACAAAGCGA // AGTCGTTCGTGTCTTCCGAAACT 11 phi109642 2.03-2.04 ACGG CTCTCTTTCCTTCCGACTTTCC // GAGCGAGCGAGAGAGATCG 12 phi101049 2.10 AGAT CCGGGAACTTGTTCATCG // CCACGTCCATGATCACACC 13 phi102228 3.06 AAGC ATTCCGACGCAATCAACA // TTCATCTCCTCCAGGAGCCTT
14 phi093 4.08 AGCT AGTGCGTCAGCTTCATCGCCTACAAG // AGGCCATGCATGCTTGCAACAATGGATACA 15 umc1153 5.09 (TCA)4 CAGCATCTATAGCTTGCTTGCATT // TGGGTTTTGTTTGTTTGTTTGTTG
16 phi423796 6.01 AGATG CACTACTCGATCTGAACCACCA // CGCTCTGTGAATTTGCTAGCTC 17 phi114 7.03 GCCT CCGAGACCGTCAAGACCATCAA // AGCTCCAAACGATTCTGAACTCGC 18 phi420701 8.00 CCG GATGTTTCAAAACCACCCAGA // ATGGCACGAATAGCAACAGG 19 phi448880 9.06-9.07 AAG CGATCCGGAGGAGTTCCTTA // CCATGAACATGCCAATGC 20 phi96342 10.02 ATCC GTAATCCCACGTCCTATCAGCC // TCCAACTTGAACGAACTCCTC * Sumber: Applied Biotechnology Center at CIMMYT, Mexico
Analisis Data Genotipik
Analisis data molekuler dilakukan berdasarkan hasil skoring pita DNA yang muncul pada plate, hasil skoring dalam bentuk data biner. Tingkat polimorfisme (PIC = Polimorphism Information Content) dari primer yang digunakan dihitung untuk masing-masing marka SSRs (Smith et al. 1997), dengan formula:
n fi PIC 1 21 i = 1, 2, 3,………n , dimana
f
i2 adalah frekuensi alel ke-i. Koefisien korelasi kofenitik (r) dihitung dengan menggunakan program NTSYS 2.1.29 Analisis Tingkat Heterosigositas
Salah satu kelebihan dari metode SSRs adalah deteksinya kodominan sehingga lokus yang heterozigot akan dapat dibedakan dari lokus homozigot. Lokus yang homozigot akan mucul hanya satu pita/alel per primer per genotipe. Jika lebih dari satu alel berarti lokus tersebut heterozigot. Analisis ini penting untuk menghindari terseleksinya genotipe-genotipe dengan tingkat heterosigositas yang tinggi dimana pada pengamatan secara fenotipik tidak terdeteksi karena pengaruh faktor lingkungan. Tingkat heterosigositas untuk setiap genotipe dapat diketahui dengan formula: x 100% digunakan yang SSRs lokus Total t heterozigo lokus Jumlah sitas heterozigo Persentase
Untuk memperoleh hasil analisis data yang lebih akurat, maka dalam penelitian ini hanya genotipe yang mempunyai tingkat heterozigositas <20% yang dianalisis lebih lanjut.
Estimasi Kekerabatan Genetik dan Analisis Klaster
Tingkat kemiripan genetik (GS=genetik similarity) diestimasi dengan menggunakan koefisien Jaccard (Rohlf, 2000) dengan formula:
n u
m S
,
dimana m = jumlah pita (alel) DNA yang sama posisinya, n = total pita (alel) DNA, dan u = jumlah pita (alel) DNA yang tidak sama posisinya. Kemiripan genetik dianalisis berdasarkan Unweighted Pair Group Method using Arithmetic Averages
(UPGMA) dengan menggunakan software NTSYS-pc versi 2.1 (Rohlf 2000). Analisis matriks jarak genetik diperoleh dari hasil analisis kemiripan genetik (Lee 1998), dengan formula: S = 1 – GS, dimana S = jarak genetik, GS = Kemiripan genetik (genetik similarity). Analisis Boot-Strapping dilakukan untuk mengetahui tingkat kepercayaan pengelompokan dengan menggunakan program WinBoot. Koefisien korelasi kofenetik (r) juga dihitung yang dilanjutkan dengan uji Mantel (Mantel 1967) untuk melihat goodness of fit dari hasil analisis klaster.
30
Percobaan 2. Korelasi antara tingkat kemiripan berdasarkan marka SSRs