A. BOTANI PISANG
III. METODE PENELITIAN
2. Analisis Kimia dan Nilai Biologis
a. Kadar Pati (AOAC 1995)
Sebanyak 3 g sampel dicuci dengan menggunakan etanol 80% sebanyak 30 ml secara maserasi untuk menghilangkan gula-gula sederhana pada suhu kamar selama 15 menit. Suspensi disaring dengan kertas saring dan dicuci dengan akuades sampai volume filtrat mencapai 250 ml. residu kertas saring dicuci 5 kali dengan 10 ml eter untuk menghilangkan lemak. Selanjutnya sampel dibiarkan untuk menguapkan eter dari residu dan dicuci lagi dengan 150 ml alkohol 10% untuk membebaskan lebih lanjut karbohidrat yang terlarut. Residu pada kertas saring kemudian dikeringkan dengan menggunakan sinar matahari selama 3 jam.
18 Analisis kadar pati dengan metode hidrolisis langsung oleh asam (Direct Acid Hydrolysis). Selanjutnya sebanyak 0.5 g sampel ditimbang dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Lalu ditambahkan 25 ml akuades dan 5 ml HCl 25%. Erlenmeyer ditutup dan dipanaskan dalam waterbath pada suhu 100°C. setelah dingin larutan yang terbentuk dinetralkan dengan NaOH 25%, disaring, dan ditepatkan hingga 100 ml. Penentuan kadar pati dinyatakan sebagai glukosa pada filtrat. Total glukosa dianalisis dengan menggunakan metode DNS.
Sebanyak 1 ml sampel (telah dihidrolisis dengan asam, dinetralkan, disaring dan ditepatkan hingga volume 100 ml) dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 2 ml pereaksi DNS. Setelah itu dipanaskan dalam waterbath pada suhu 100°C selama 10 menit lalu didinginkan pada suhu ruang. Sampel kemudian diencerkan dengan penambahan 10 ml akuades dan diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 550 nm. Akuades digunakan sebagai blanko. Kurva standar dibuat menggunakan larutan glukosa standar, yaitu 5000 ppm sebagai larutan induk. Larutan kerja yang digunakan sebagai standar adalah 500 ppl, 1000 ppm, 1500 ppm, 2000 ppm, 2500 ppm, 3000 ppm, 3500 ppm, 4000 ppm, 4500 ppm, dan 5000 ppm. Persen pati diperoleh dengan mengalikan persen glukosa dengan faktor koreksi 0.9.
% Pat i = A S x FP W x 100 x 0.9 Keterangan : A = Absorbansi sampel
S = Slope atau kemiringan kurva Fp = Faktor Pengenceran W = Berat sampel (g)
b.
Kadar Pati Resisten (Goni et al. 1998)
Sebanyak 100 mg sampel kering yang telah bebas lemak dimasukkan ke dalam tabung sentrifus, kemudian ditambahkan 10 ml buffer KCl-HCl pH 1.5 (penepatan pH menggunakan HCl 2M atau NaOH 0.5M) dan dihomogenkan. Larutan pepsin (1 g pepsin/10 ml buffer KCl-HCl) ditambahkan sebanyak 0.2 ml dan dikocok. Setelah itu dimasukan ke dalam penangas air bergoyang suhu 40 0C selama 60 menit. Dinginkan pada suhu ruang dan tambahkan buffer fosfat pH 6.9 sebanyak 9 ml (penepatan pH menggunakan HCl 2M atau NaOH 0.5M). Tambahkan 1 ml larutan α-amylase (40 mg α- amylase per ml buffer fosfat), dikocok dan diinkubasi selama 16 jam dalam penangas air bergoyang suhu 37 0C.
Sampel disentrifus selama 15 menit dengan kecepatan 3000 g, kemudian supernatan dibuang. Cuci residu dengan air destilata sebanyak 10 ml, kocok lalu sentrifus kembali dan buang kembali supernatannya. Tambahkan 3 ml KOH 4M, kocok dan letakkan pada suhu ruang dengan penggoyangan yang konstan selama 30 menit. Setelah itu tambahkan 5.5 ml HCl 2M dan 3 ml buffer sodium asetat 0.4M pH 4.75 (penepatan pH menggunakan HCl 2M atau NaOH 0.5M). Tambahkan amyloglucosidase (AMG) sebanyak 80l, kocok lalu letakan pada penangas air bergoyang suhu 60 0C selama 45 menit.
Sampel disentrifus kembali selama 15 menit dengan kecepatan 3000 g, supernatan dipisahkan dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Cuci residu dengan 10 ml air destilata, sentrifus kembali dan supernatan dicampurkan dengan supernatan sebelumnya, kocok hingga homogen. Sampel kemudian diencerkan hingga 100x pengenceran.
Sebanyak 0.5 ml sampel diambil, kemudian ditambahkan pereaksi fenol sebanyak 0.5 ml, dikocok, ditambahkan 2.5 ml H2SO4, diamkan pada suhu ruang selama 10 menit, kocok. Lalu diinkubasi pada suhu 27 0C selama 15 menit. Sampel diukur dengan menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 490 nm.
19 Kurva standar dibuat dengan menggunakan larutan glukosa standar 100 ppm sebagai larutan induk. Larutan kerja yang digunakan sebagai standar, yaitu 10 ppm, 20 ppm, 30 ppm, 40 ppm, 50 ppm, 60 ppm, 70 ppm, 80 ppm, 90 ppm dan 100 ppm. Persen pati resisten diperoleh dengan cara mengalikan persen glukosa dengan faktor koreksi 0.9. % Pat i Resisten = A S x FP W x 100 x 0.9 Keterangan : A = Absorbansi sampel
S = Slope atau kemiringan kurva FP = Faktor pangenceran W = Berat sampel (g)
c.
Uji Daya Cerna Pati secara in vitro (Anderson et al. 2002)
Enzim α-amilase dilarutkan di dalam buffer Na-Fosfat 0.05 M pH 7. Pereaksi dinitrosalisilat (DNS) dibuat dengan melarutkan 1 gram 3.5-dinitrosalisilat, 30 gram Na- K tartarat dan 1.6 gram NaOH dalam 100 ml akuades. Kurva standar dibuat menggunakan larutan maltosa standar, yaitu 1000 ppm sebagai larutan induk. Larutan kerja yang digunakan sebagai standar adalah 100 ppm, 200 ppm, 300 ppm, 400 ppm, 500 ppm, 600 ppm, 700 ppm, 800 ppm, 900 ppm dan 1000 ppm. Sebanyak 0.5 gram pati disuspensikan dalam 50 ml akuades sehingga diperoleh konsentrasi 1% w/v, kemudian dipanaskan dalam waterbath suhu 90°C selama 30 menit kemudian didinginkan. Sebanyak 2 ml sampel dipindahkan ke dalam tabing reaksi, ditambahkan 3 ml akuades, dan 5 ml buffer Na-Fosfat 0.1 M, pH 7. Lalu diinkubasi pada suhu 37°C selama 15 menit. Selanjutnya ditambahkan 5 ml larutan α-amilase dan diinkubasi lagi pada suhu 37°C selama 30 menit.
Sebanyak 1 ml sampel dari tabung reaksi dipipet dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi lain, ditambah 2 ml pereaksi dinitrosalisilat (DNS). Lalu dipanaskan pada suhu 100°C selama 10 menit. Warna merah jingga yang terbentuk diukur absorbansinya pada panjang gelombang 520 nm. Kadar maltosa campuran reaksi dihitung dengan menggunakan kurva standar maltosa murni yang diperoleh dengan mereaksikan larutan maltosa standar dengan pereaksi dinitrosalisilat (DNS) menggunakan prosedur seperti di atas. Blanko dibuat untuk menghitung kadar maltosa awal (bukan hasil hidrolisis enzim). Prosedur pembuatan blanko sama seperti prosesdur untuk sampel hanya saja tanpa
sampel dan tidak ditambahkan larutan enzim α-amilase. Sebagai gantinya untuk blanko
diganti buffer Na-Fosfat 0.1 M pH 7.
% DC Pat i = ( kadar maltosa−kadar maltosa bl anko) sampel
( kadar maltosa−kadar maltosa blanko) pati mur nix 100%
d.
Kadar Serat Pangan (Asp et al. 1983)
Persiapan Sampel
Sampel dikeringkan terlebih dahulu dengan oven vakum, kemudian diekstraksi lemak dengan menggunakan petroleum eter selama semalam dengan dilakukan pengadukan menggunakan stirrer. Setelah itu dikeringkan kembali dengan
20 menggunakan oven vakum. Sampel yang telah bebas lemak ditimbang sebanyak 1 gram, dimasukkan ke dalam erlenmeyer, ditambahkan 25 ml buffer natrium fosfat 0.1M pH 6 dan diaduk. Penambahan buffer berguna untuk menstabilkan enzim termamyl. Ke dalam erlenmeyer ditambahkan enzim termamyl sebanyak 0.1 ml, kemudian erlenmeyer ditutup dengan aluminium foil dan diinkubasi dalam penangas air suhu 100 0C selama 15 menit, lalu didinginkan pada suhu ruang. Tujuan penambahan termamyl dan pemanasan adalah untuk memecah pati dengan menggelatinisasi terlebih dahulu. Kemudian ditambahkan 20 ml air destilata dan pH diatur menjadi 1.5 menggunakan HCl. Pengaturan pH ini dimaksudkan agar kondisi lingkungan optimum bagi aktivitas pepsin. Setelah itu, ditambahkan pepsin sebanyak 100 mg, erlenmeyer ditutup dan diinkubasi dalam penangas air bergoyang suhu 400C selama 60 menit.
Air destilata ditambahkan sebanyak 20 ml, lalu pHnya diatur menjadi 6.87 (dengan menggunakan NaOH) yang merupakan pH optimum bagi aktivitas enzim pankreatin. Ditambahkan enzim pankreatin sebanyak 100 mg, kemudian erlenmeyer ditutup dan diinkubasikan dalam penangas air bergoyang pada suhu 40 0C selama 60 menit. Lalu pH diatur menjadi 4.5 dengan menggunakan HCl, kemudian disaring menggunakan kertas saring yang telah ditimbang beratnya (KS1) dan dicuci 2 kali dengan 10 ml air destilata. Setelah proses ini didapatkan residu dan filtrat.
Penentuan Kadar Serat Pangan Tidak Larut (IDF)
Residu yang didapat dari tahap persiapan sampel dicuci 2 kali dengan menggunakan etanol 95% 10 ml dan etanol 10 ml. Kemudian ditimbang beratnya bersama dengan kertas saring yang digunakan (KS2). Selanjutnya KS2 dikeringkan pada suhu 105 0C sampai beratnya tetap (semalam) dan ditimbang setelah didinginkan dalam desikator (CW2). Residu diabukan dalam tanur pada suhu 5500C selama 5 jam, didinginkan dalam desikator dan ditimbang setelah dingin (CW1).
Penentuan Kadar Serat Pangan Larut (SDF)
Filtrat yang didapat dari tahap persiapan sampel ditepatkan volumenya sampai 100 ml dengan menggunakan labu takar 100 ml. Larutan dituang ke dalam gelas piala lalu ditambahkan 400 ml etanol 95% hangat (60 0C) dan dibiarkan mengendap selama 1 jam. Larutan disaring dengan menggunakan kertas saring yang telah ditimbang beratnya (KS3). KS3 ini kemudian dicuci 2 kali dengan menggunakan etanol 95% 10 ml dan dua kali dengan aseton 10 ml. Residu yang dihasilkan ditimbang bersama kertas saring yang digunakan (KS4). KS4 kemudian dikeringkan pada suhu 105 0C sampai beratnya tetap (semalam) dan ditimbang setelah didinginkan dalam desikator (R2). Residu diabukan dalam tanur pada suhu 5500C selama 5 jam, didinginkan dalam desikator dan ditimbang setelah dingin (CW3).
Pembuatan Blanko
Blanko untuk serat pangan tidak larut (IDF) dan serat pangan larut (SDF) diperoleh dengan cara yang sama pada tahap persiapan sampel tetapi pada pembuatan blanko tidak digunakan sampel dan semua pereaksi yang digunakan dalam tahap persiapan sampel harus digunakan. Dari tahap pembuatan blanko juga didapat residu dan filtrat. Residu yang didapat diberikan perlakuan yang sama seperti pada tahap penentuan kadar serart pangan tidak larut. Berat residu detelah dikeringkan dan diabukan digunakan sebagai blanko untuk penentuan kadar serat pangan tidak larut. Berat filtrat setelah dikeringkan dan diabukan digunakan sebagai blanko untuk penentuan kadar serar pangan larut. Perhitungan Serat Pangan
IDF ( %bb) = ( (KS2−KS1)−A X 100( CW2−CW1) )−B1 100−( Ka−Kl)
21 SDF ( %bb) = ( (KS4−KS3)−A X 100( CW4−CW3))−B2 100−( Ka−Kl ) x 100% TDF = IDF + SDF Keterangan :
A : Berat sampel kering bebas lemak B1 : Berat blanko bebas abu untuk IDF B2 : Berat blanko bebas abu untuk SDF Ka : Kadar air sampel
Kl : Kadar lemak sampel KS1 & KS3 : Kertas saring kosong KS2 & KS4 : Kertas saring + residu CW1 & CW3: Cawan Porselen kosong CW2 & CW4: Cawan Porselen + abu