BAB III METODE PENELITIAN
3.10 Analisis Data
Data hasil penellitian dianalisis dengan menggunakan program SPSS. Data hasil penelitian ditentukan homogenitas dan normalitasnya untuk menentukan analisis statistik yang digunakan. Data dianalisis dengan menggunakan uji ANAVA satu arah untuk menentukan perbedaan rata-rata di antara perlakuan. Jika terdapat perbedaan, dilanjutkan dengan menggunakan uji Post Hoc Tukey
untuk mengetahui variabel mana yang memiliki perbedaan. Berdasarkan nilai signifikansi, p < 0,05 dianggap signifikan. Data ditampilkan dalam rerata ± SEM.
BAB III
METODE PENELITIAN
Metode penelitian yang dilakukan adalah penelitian eksperimental. Penelitian meliputi beberapa tahapan yaitu penyiapan sampel, karakterisasi simplisia, karakterisasi ekstrak, skrining fitokimia serbuk simplisia, skrining fitokimia ekstrak, pembuatan ekstrak, pembuatan sediaan, penyiapan hewan percobaan, dan pengujian penghambatan degranulasi mastosit pada hewan percobaan secara in vitro dengan menggunakan alat improved neubauer hemocytometer. Data hasil penelitian dianalisis secara ANAVA (analisis variansi) dan dilanjutkan dengan uji Post Hoc Tukey meggunakan program SPSS 17 (Statistical Product and Service Solution).
3.2Alat dan Bahan 3.2.1 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah alat-alat gelas, aluminium foil, blender (National), oven listrik, neraca listrik (Vibra), seperangkat alat destilasi penetapan kadar air, rotary evaporator (Heidolph WB 2000), seperangkat alat bedah, spuit 1 ml dan 10 ml, improved neubauer hemocytometer (Marienfield), alat sentrifuge (Dynamic), waterbath, termometer, mikroskop (Boeco), neraca hewan, microtube, pipet mikro (Socorex), lumpang dan stamfer. Gambar alat-alat yang digunakan dapat dilihat pada Lampiran 5.
3.1.2 Bahan-bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun bangun- bangun, etanol 96% (destilasi), toluen (p.a), putih telur ayam, aminofilin injeksi, dimetil sulfoksida (DMSO), larutan NaCl fisiologis 0,9%, kalium iodida, merkuri (II) klorida, bismut nitrat, asam nitrat, iodium, asam asetat anhidrat, asam sulfat 98%, amil alkohol, kloroform, besi (III) klorida, timbal (II) asetat, natrium hidroksida, asam klorida 37%, metanol (teknis), etil asetat (teknis), serbuk seng, serbuk magnesium, isopropanol, biru toluidin, trypan blue 0,4%, gelatin 0,1 %, heparin, asam asetat glasial, formaldehid 37%, natrium klorida (NaCl), kalium klorida (KCl), dinatrium hidrogen fosfat (Na2HPO4), kalium dihidrogen fosfat (KH2PO4),aqua bidestilasi.
3.2 Hewan Percobaan
Hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian adalah mencit jantan sehat dengan berat 35 gram berumur 3 bulan sebanyak 5 ekor yang diambil cairan intraperitonealnya untuk perlakuan degranulasi mastosit tersensitisasi aktif. Sebelum digunakan sebagai hewan percobaan, semua mencit dipelihara terlebih dahulu selama satu minggu untuk penyesuaian lingkungan, mengontrol kesehatan dan berat badan serta menyeragamkan makanannya. Mencit yang sehat ditandai dari berat badan yang tetap atau mengalami kenaikan berat badan yang teratur, mata berwarna merah, dan gerakan yang gesit dan lincah.
3.3 Penyiapan Tumbuhan
Penyiapan tumbuhan meliputi pengambilan tumbuhan, identifikasi tumbuhan dan pengolahan tumbuhan.
3.3.1 Pengambilan Tumbuhan
Pengambilan tumbuhan daun bangun-bangun dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain. sampel diperoleh di, Jl. Pales V No. 57 Pokok Mangga Padang Bulan, Simpang Selayang Medan, Provinsi Sumatera Utara.
3.3.2 Identifikasi Tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor.
3.3.3 Pengolahan Tumbuhan
Bahan baku daun bangun-bangun yang masih segar dikumpulkan, dibuang bagian yang tidak diperlukan (sortasi basah), dicuci bersih di bawah air mengalir, ditiriskan, dan ditimbang berat basahnya (7.765 g). Selanjutnya dikeringkan dengan menggunakan lemari pengering dengan tujuan agar daun tidak membusuk pada saat proses pengeringan. Daun kering ditandai dengan daun mudah diremukkan, kemudian daun ditimbang kembali sebagai berat kering (870 g) lalu diblender dan ditimbang sebagai berat serbuk simplisia (793 g). Serbuk simplisia dimasukkan ke dalam wadah plastik, diberi etiket dan disimpan di tempat kering terlindung dari cahaya matahari.
3.7Skrining Fitokimia Serbuk Simplisia
Skrining fitokimia serbuk simplisia meliputi pemeriksaan alkaloida, pemeriksaan flavonoida, pemeriksaan tanin, pemeriksaan glikosida, pemeriksaan saponin, pemeriksaan steroid/triterpenoid.
3.7.1 Pemeriksaan alkaloida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit, didinginkan lalu disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan berikut (Ditjen POM, 1995):
d. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan pereksi Mayer akan terbentuk endapan berwarna putih atau kuning
e. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan pereksi Bouchardat akan terbentuk endapan berwarna coklat-hitam
f. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan pereksi Dragendorff akan terbentuk endapan berwarna merah atau jingga.
Alkaloida dinyatakan positif jika terjadi endapan atau terjadi endapan paling sedikit dua atau tiga dari percobaan di atas.
3.7.2 Pemeriksaan flavonoida
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia ditambahkan 100 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas. Kedalam 5 ml filtrat ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoida positif jika terjadi warna merah, kuning, jingga pada lapisan amil alkohol (Farnsworth, 1966).
3.7.3 Pemeriksaan tanin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia disari dengan 10 ml air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna. Diambil 2 ml larutan dan ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi (III) klorida 1%. Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin (Farnsworth, 1966).
3.7.4 Pemeriksaan glikosida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 3 g kemudian disari dengan 30 ml campuran 7 bagian volume etanol 96% dan 3 bagian volume air suling, selanjutnya ditambahkan 10 ml HCl 2 N, dipanaskan selama 10 menit, didinginkan dan disaring. Pada 30 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal (II) asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan selama 5 menit lalu disaring. Filtrat disari sebanyak 3 kali, tiap kali dengan 20 ml campuran 3 bagian volume kloroform dan 2 bagian volume isopropanol. Diambil lapisan air kemudian ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molisch, ditambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat pekat terbentuk cincin warna ungu pada batas kedua cairan menunjukkan adanya ikatan gula (Ditjen POM, 1995).
3.7.5 Pemeriksaan saponin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 10 ml air suling panas, didinginkan kemudian dikocok kuat- kuat selama 10 detik, timbul busa yang mantap tidak kurang dari 10 menit setinggi 1-10 cm. Ditambahkan 1 tetes larutan asam klorida 2 N, bila buih tidak hilang menunjukkan adanya saponin (Ditjen POM, 1995).
3.7.6 Pemeriksaan steroida/triterpenoida
Sebanyak 1 g serbuk simplisia dimaserasi dengan 20 ml eter selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa dalam cawan penguap ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat. Timbul warna ungu atau merah kemudian berubah menjadi hijau kebiruan menunjukkan adanya steroida triterpenoida (Harborne, 1987).
3.8 Karakterisasi Simplisia
Karakterisasi simplisia meliputi pemeriksaan penetapan kadar air, penetapan kadar sari yang larut dalam air, penetapan kadar sari yang larut dalam etanol, penetapan kadar abu total, dan penetapan kadar abu tidak larut asam (Ditjen POM, (1995).
3.8.1 Penetapan kadar air simplisia
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi (destilasi toluene). Alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, alat penampung, pendingin, tabung penyambung dan tabung penerima (WHO, 1998).
Cara penetapan:
Kedalam labu bulat dimasukkan 200 ml toluene dan 2 ml air suling, didestilasi selama 2 jam. Setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes per detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes per detik sampai semua air terdestilasi. Setelah itu toluene didinginkan dan volume air di dalam tabung penerimaan dibaca. Kemudian kedalam labu alas bulat dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah
ditimbang, Setelah 2 jam didestilasi, kemudian toluene dibiarkan dingin, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluene yang telah dijenuhkan. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin sampai suhu kamar. Setelah air dan toluene memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen.
3.8.2 Penetapan kadar sari yang larut dalam air
Sebanyak 5 gram serbuk simplisia, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air kloroform (2,5 ml kloroform dalam air suling 1000 ml) dalam labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, dibiarkan selama 18 jam, kemudian disaring. Diuapkan 20 ml filtrat sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105°C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (Ditjen POM, 1995).
3.8.3 Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol
Sebanyak 5 gram serbuk simplisia, dimaserasi selama 24 jam dalam etanol 96% dalam labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, dibiarkan selama 18 jam, kemudian disaring. Diuapkan 20 ml filtrat sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105°C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam etanol (96%) dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (Ditjen POM, 1995).
3.8.4 Penetapan kadar abu total
Sebanyak 2 gram serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus platina atau krus silikat yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pemijaran dilakukan pada suhu 600°C selama 3 jam. Kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (Ditjen POM, 1995).
3.8.5 Penetapan kadar abu tidak larut asam
Abu yang telah diperoleh dalam penetapan abu dididihkan dengan 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan, disaring dengan kertas masir atau kertas saring bebas abu, cuci dengan air panas, dipijarkan sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bobot yang dikeringkan di udara (Ditjen POM, 1995).
3.9 Skrining Fitokimia Ekstrak Etanol Daun Bangun-bangun
Skrining fitokimia ekstrak etanol daun bangun-bangun meliputi pemeriksaan alkaloida, pemeriksaan flavonoida, pemeriksaan tanin, pemeriksaan glikosida, pemeriksaan saponin, pemeriksaan steroid/triterpenoid. 3.9.1 Pemeriksaan alkaloida
Ekstrak ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit, didinginkan lalu disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan berikut (Ditjen POM, 1995):
d. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan pereksi Mayer akan terbentuk endapan berwarna putih atau kuning
e. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan pereksi Bouchardat akan terbentuk endapan berwarna coklat-hitam
f. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan pereksi Dragendorff akan terbentuk endapan berwarna merah atau jingga.
Alkaloida dinyatakan positif jika terjadi endapan atau terjadi endapan paling sedikit dua atau tiga dari percobaan di atas.
3.9.2 Pemeriksaan flavonoida
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia ditambahkan 100 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas. Kedalam 5 ml filtrat ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoida positif jika terjadi warna merah, kuning, jingga pada lapisan amil alkohol (Farnsworth, 1966).
3.9.3 Pemeriksaan tanin
Sebanyak 0,5 g ekstrak disari dengan 10 ml air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna. Diambil 2 ml larutan dan ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi (III) klorida 1%. Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin (Farnsworth, 1966).
3.9.4 Pemeriksaan glikosida
Ekstrak ditimbang sebanyak 3 g kemudian disari dengan 30 ml campuran 7 bagian volume etanol 96% dan 3 bagian volume air suling, selanjutnya ditambahkan 10 ml HCl 2 N, dididihkan selama 10 menit, didinginkan dan disaring. Pada 30 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal (II) asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan selama 5 menit lalu disaring. Filtrat disari sebanyak 3 kali, tiap kali dengan 20 ml campuran 3 bagian volume kloroform dan 2 bagian volume isopropanol. Diambil lapisan air kemudian ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molisch, ditambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat pekat terbentuk cincin warna ungu pada batas kedua cairan menunjukkan adanya ikatan gula (Ditjen POM, 1995).
3.9.5 Pemeriksaan saponin
Sebanyak 0,5 g ekstrak dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 10 ml air suling panas, didinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik, timbul busa yang mantap tidak kurang dari 10 menit setinggi 1-10 cm. Ditambahkan 1 tetes larutan asam klorida 2 N, bila buih tidak hilang menunjukkan adanya saponin (Ditjen POM, 1995).
3.9.6 Pemeriksaan steroida/triterpenoida
Sebanyak 1 g ekstrak dimaserasi dengan 20 ml eter selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa dalam cawan penguap ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat. Timbul warna ungu atau merah kemudian berubah menjadi hijau kebiruan menunjukkan adanya steroida triterpenoida (Harborne, 1987).
3.7 Pembuatan Ekstrak Daun Bangun-bangun
Pembuatan ekstrak dilakukan secara maserasi dengan menggunakan pelarut etanol 96%. Caranya, serbuk simplisia (700 g) dimasukkan kedalam bejana yang tertutup, cairan penyari dituangi sampai semua simplisia terendam dan ditutup, dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya sambil sesekali diaduk. Kemudian, setelah 5 hari campuran tersebut diserkai, ampasnya dimaserasi dengan etanol 96% disimpan dalam bejana tertutup dan dibiarkan di tempat sejuk, terlindung dari cahaya selama 2 hari, kemudian dienaptuangkan. Maserat yang diperoleh dipekatkan dengan alat rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental (Depkes RI, 1979).
3.8 Pemeriksaan Karakterisasi Ekstrak Daun Bangun-bangun
Pemeriksaan karakterisasi ekstrak daun bangun-bangun sama seperti karakterisasi yang dilakukan pada simplisia meliputi penetapan kadar air, penetapan adar abu total, dan penetapan kadar abu tidak larut dalam asam.
3.9 Uji Aktivitas Penghambatan Degranulasi Mastosit
Uji aktivitas penghambatan degranulasi mastosit meliputi penyiapan sediaan, penyiapan hewan percobaan dan uji degranulasi mastosit tersentisasi aktif.
3.9.1 Penyiapan sediaan
Penyiapan sediaan meliputi penyiapan larutan antigen putih telur ayam 50%, penyiapan larutan PBS (Phosphate Buffered Saline), penyiapan larutan biru toluidin, penyiapan larutan trypan blue 0,4%, penyiapan larutan uji yaitu
ekstrak etanol daun bangun-bangun (EEDBB) dengan berbagai konsentrasi, penyiapan larutan aminofilin 100 µg/ml (Alvianti, dkk., 2012).
3.9.2 Penyiapan larutan antigen putih telur ayam 50%
Sebanyak 5 ml putih telur ayam ditambahkan dalam 5 ml NaCl fisiologis 0,9%, kemudian dilakukan pengenceran dengan mengambil 5 ml larutan di atas lalu dicukupkan volumenya hingga 10 ml dengan larutan NaCl fisiologis 0,9% sehingga diperoleh induk, kemudian diambil 5 ml larutan induk dan dicukupkan volumenya hingga 10 ml dengan larutan NaCl fisiologis 0,9% sehingga diperoleh konsentrasi 50% (Alvianti, dkk., 2012).
3.9.3 Penyiapan larutan phosphate buffered saline (PBS)
Phosphate Buffered Saline (PBS) adalah larutan penyangga yang umum digunakan dalam penelitian. Pembuatan PBS dilakukan dengan cara sebagai berikut: sebanyak 8 gram NaCl, 0,2 gram KCl, 1,44 gram Na2HPO4, 0,24 gram KH2PO4, dilarutkan dalam 800 ml aqua bidestilasi, kemudian dicek pH dengan indikator pH hingga pH ± 7 dan dapat disesuaikan dengan penambahan HCl atau NaOH, tambahkan aqua bidestilasi hingga 1 L (Alvianti, dkk., 2012). 3.9.4 Penyiapan larutan biru toluidin
Sebanyak 39 ml larutan NaCl fisiologis 0,9% dicampur dengan 1 ml asam asetat glasial, 10 ml formaldehid 37% (v/v) dan 50 ml etanol 95% (v/v), kemudian campuran dikocok dan ditambahkan biru toluidin sebanyak 100 mg dan dikocok lagi hingga larut (Handayani, dkk., 2008).
3.9.5 Penyiapan larutan trypan blue 0,4%
Sebanyak 200 mg serbuk trypan blue dilarutkan dalam 50 ml larutan PBS dengan pH ±7 dan dikocok hingga larut.
3.9.6 Penyiapan larutan ekstrak etanol daun bangun-bangun (EEDBB) Sebanyak 100 mg ekstrak etanol daun bangun-bangun dilarutkan dalam 1 ml larutan DMSO 1% sehingga didapatkan konsentrasi 100 mg/ml, kemudian dilakukan pengenceran dengan mengambil 0,1 ml larutan ekstrak etanol daun bangun-bangun konsentrasi 100 mg/ml di atas lalu ditambahkan dengan larutan
DMSO 1% hingga 1 ml sehingga diperoleh konsentrasi 10.000 μg/ml,
kemudian diambil 0,1 ml larutan ekstrak etanol daun bangun-bangun konsentrasi 10.000 μg/ml di atas dan ditambahkan dengan larutan DMSO 1% hingga volume 1 ml sehingga diperoleh konsentrasi 1.000 μg/ml, lalu diambil 0,1 ml larutan ekstrak etanol daun bangun-bangun konsentrasi 1.000 μg/ml ditambahkan dengan larutan DMSO 1% hingga 1 ml sehingga diperoleh konsentrasi 100 ug/ml, lalu diambil 0,36 ml larutan ekstrak etanol daun bangun-bangun konsentrasi 100 μg/ml ditambahkan dengan larutan DMSO 1% hingga 6 ml sehingga diperoleh konsentrasi 6 ug/ml, demikian seterusnya
sampai diperoleh konsentrasi 5 μg/ml, 4 μg/ml, γ μg/ml, β μg/ml. Perhitungan
terlampir pada Lampiran 9, halaman 71.
3.9.7 Penyiapan larutan aminofilin 100 µg/ml
Sebanyak β1 μl larutan aminofilin injeksi dengan konsentrasi dosis 24
mg/ml, dipipet dengan menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam labu tentukur 5 ml. Kemudian dilakukan pengenceran dengan penambahan larutan dimetil sulfoksida (DMSO) 1% hingga 5 ml, sehingga diperoleh
konsentrasi 100 μg/ml (Alvianti, dkk., β01β). Perhitungan terlampir pada
3.9.8 Penyiapan hewan percobaan
Hewan yang digunakan adalah mencit jantan sehat dengan berat 35 g berumur 3 bulan sebanyak 5 ekor yang mendapat perlakuan yang sama. Tiap 1 ekor mencit diambil cairan intraperitonealnya dan dibagi atas 8 kelompok: Kelompok 1 (Normal):
Suspensi mastosit yang tidak diberi penambahan larutan antigen (putih telur ayam) maupun EEDBB dan aminofilin. Kelompok 2 (Kontrol positif):
Suspensi mastosit yang diberikan larutan antigen putih telur ayam 50% dan larutan aminofilin 100 µg/ml.
Kelompok 3 (Kontrol negatif):
Suspensi mastosit yang diberikan larutan antigen putih telur ayam 50% dan DMSO 1% tetapi tidak diberikan EEDBB ataupun aminofilin.
Kelompok 4 (Uji 1):
Suspensi mastosit yang diberikan larutan antigen putih telur ayam 50% dan EEDBB 2µ g/ml.
Kelompok 5 (Uji 2):
Suspensi mastosit yang diberikan larutan antigen putih telur ayam 50% dan EEDBB 3µ g/ml.
Kelompok 6 (Uji 3):
Suspensi mastosit yang diberikan larutan antigen putih telur ayam 50% dan EEDBB 4µ g/ml.
Kelompok 7 (Uji 4):
Suspensi mastosit yang diberikan larutan antigen putih telur ayam 50% dan EEDBB 5µ g/ml.
Kelompok 8 (Uji 5):
Suspensi mastosit yang diberikan larutan antigen putih telur ayam 50% dan EEDBB 6µ g/ml.
3.9.9 Perhitungan sel pada hemocytometer
Hemositometer terdiri dari 4 kamar hitung (A, B, C, dan D), setiap kamar hitung terdiri dari 16 kotak, hitung sel pada 4 kamar hemositometer dengan menggunakan mikroskop.
Hitung jumlah sel per ml dengan rumus (Louis, 2011):
3.9.10 Penyiapan suspensi mastosit tersensitisasi aktif
Sebanyak 5 ekor mencit sehat dengan berat badan 35 g disensitisasi oleh antigen putih telur ayam. Mencit disuntik secara intraperitoneal dengan 0,3 ml antigen putih telur ayam 50%, pada hari ke-1. Pada hari ke-3 dan hari ke-5 diulangi lagi penyuntikan antigen putih telur ayam 50% sebanyak 0,05 ml secara intra plantar. Pada hari ke-10 setelah penyuntikan pertama dilakukan isolasi mastosit dari cairan intraperitoneal (Choudary, 2010; Vogel, 2008), mencit dipuasakan selama 18 jam, kemudian mencit yang telah dipuasakan langsung dikorbankan dengan cara dislokasi leher dan segera disuntik dengan 10 ml larutan PBS yang telah ditambah dengan gelatin 0,1% dan heparin 50
selama 10 menit, dibedah secara hati-hati dan diambil cairan peritoneal sebanyak mungkin, masukkan ke dalam tabung sentrifuge dan sentrifuge selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm, bagian supernatan dibuang dan endapan dicuci dua kali dengan larutan PBS sama banyak, kemudian endapan diambil dan dicukupkan volume hingga 2 ml dengan larutan PBS dan siap untuk pengujian (Alvianti, dkk., 2012).
3.9.11 Uji ketahanan sel (Cell Viability Test)
Uji ketahanan sel dilakukan untuk melihat sel uji yang tetap utuh dengan penambahan larutan uji dosis maksimal dan diinkubasi selama beberapa jam. Pengujian ini menggunakan metode pewarnaan oleh trypan blue, sel yang utuh adalah sel yang tidak berwarna, sedangkan sel yang terdegranulasi adalah sel yang berwarna biru.
Sebanyak 50 µl suspensi mastosit yang telah diisolasi dari peritoneal mencit, dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan 50 µl larutan uji EEDBB 6 µg/ml dan ditepuk-tepuk secara perlahan sampai homogen. Inkubasi pada suhu 37oC selama 1 jam. Diambil 100 µl larutan tersebut kemudian ditambahkan 100 µl larutan trypan blue 0,4% dan ditepuk-tepuk secara perlahan sampai homogen. Teteskan larutan 10 µl di atas hemositometer dan hitung sel yang berwarna biru dibawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 40. Persen ketahanan sel dihitung dengan rumus sebagai berikut (Sudira, 2011):
% Vs = x100%
Nsm Nsh
Nsh
Dimana:
% Vs = Persen viable sel
Nsh = Jumlah sel berwarna bening Nsm = Jumlah sel biru.
3.9.12 Uji degranulasi mastosit tersensitisasi aktif
Sebanyak 5 ekor mencit yang diambil cairan intraperitonialnya mendapat perlakuan yang sama sebagai berikut:
1. Penghitungan jumlah mastosit tersensitisasi (kelompok normal).
Sebanyak 50 µl suspensi mastosit ditambahkan 40 µl PBS, 10 µl biru toluidin.
2. Penghitungan jumlah mastosit yang tidak terdegranulasi oleh DMSO 1% (kelompok kontrol negatif).
Sebanyak 50 µl suspensi mastosit ditambahkan 30 µl DMSO 1%, 10 µl antigen putih telur ayam 50%, dan 10 µl biru toluidin.
3. Pengujian aktivitas penghambatan degranulasi mastosit oleh aminofilin (kelompok kontrol positif).
Sebanyak 50 µl suspensi mastosit ditambahkan 30 µl Aminofilin 100 µg/ml, 10 µl antigen putih telur ayam 50%, dan 10 µl biru toluidin.
4. Pengujian aktivitas penghambatan degranulasi mastosit oleh ekstrak etanol daun bangun-bangun (kelompok uji) dengan konsentrasi sebagai berikut: - Sebanyak 50 µl suspensi mastosit ditambahkan 30 µl EEDBB 2 µg/ml,
10 µl antigen putih telur ayam 50%, dan 10 µl biru toluidin.
- Sebanyak 50 µl suspensi mastosit ditambahkan 30 µl EEDBB 3 µg/ml, 10 µl antigen putih telur ayam 50%, dan 10 µl biru toluidin.
- Sebanyak 50 µl suspensi mastosit ditambahkan 30 µl EEDBB 4 µg/ml, 10 µl antigen putih telur ayam 50%, dan 10 µl biru toluidin.
- Sebanyak 50 µl suspensi mastosit ditambahkan 30 µl EEDBB 5 µg/ml, 10 µl antigen putih telur ayam 50%, dan 10 µl biru toluidin.
- Sebanyak 50 µl suspensi mastosit ditambahkan 30 µl EEDBB 6 µg/ml, 10 µl antigen putih telur ayam 50%, dan 10 µl biru toluidin.
Tiap campuran yang diperoleh dari tiap kelompok ditepuk-tepuk secara perlahan agar campuran homogen, kemudian diinkubasi selama 30 menit padasuhu 37oC. Kemudian campuran diteteskan di atas hemositometer dan dihitung jumlah mastosit di bawah mikroskop dengan pembesaran 10 x 40. mastosit yang tidak terdegranulasi akan tampak berwarna keunguan karena adanya pewarnaan oleh larutan biru toluidin (Handayani, dkk., 2008).
3.9.13 Penghitungan persen jumlah mastosit terdegranulasi
Efek penghambatan degranulasi mastosit oleh ekstrak etanol daun bangun-bangun ditentukan dengan menghitung jumlah mastosit yang tidak terdegranulasi menggunakan alat hemositometer. Kemudian dari jumlah mastosit yang didapat, dihitung persentase degranulasi mastosit dengan cara sebagai berikut (Handayani, dkk., 2008).
% Degranulasi = x 100 %
Dimana:
P = Jumlah mastosit sebelum perlakuan S = Jumlah mastosit setelah perlakuan
3.10 Analisis Data
Data hasil penellitian dianalisis dengan menggunakan program SPSS. Data hasil penelitian ditentukan homogenitas dan normalitasnya untuk menentukan analisis statistik yang digunakan. Data dianalisis dengan menggunakan uji ANAVA satu arah untuk menentukan perbedaan rata-rata di antara perlakuan. Jika terdapat perbedaan, dilanjutkan dengan menggunakan uji
Post Hoc Tukey untuk mengetahui variabel mana yang memiliki perbedaan. Berdasarkan nilai signifikansi, p < 0,05 dianggap signifikan. Data ditampilkan