HASIL DAN PEMBAHASAN
D. Analisis molekular untuk melihat keberadaan gen Hd3a hasil transformasi didalam genom kalus padi hitam
Seleksi kalus hasil transformasi dapat dilakukan dengan cara menumbuhkan kalus dalam medium pertumbuhan yang mengandung antibiotik, herbisida, atau fitotoksin, tergantung gen marker yang dikloning pada plasmid dan terintegrasi ke dalam genom tanaman. Pemilihan gen marker ini tergantung pada spesies dan genotip tanaman. Toki (1997) dan Yara et al. (2001) melaporkan bahwa Higromisin 50 mg/l dapat digunakan sebagai agen penyeleksi kalus pada padi. Sel kalus yang dapat tetap hidup pada mediumMS2Dyang mengandung antibiotik higromisin dan kanamisin sebagai media seleksi dianggap sebagai tanaman kandidat transforman.Sel kalus yang hidup pada media seleksi ini disubkultur dengan medium yang sama seminggu sekali. Gambar 14 menunjukan kalus hasil transformasi pada medium MS2D dengan antibiotik kanamisin dan hygromisin dengan konsentrasi masing-masing sebanyak 50 mg/l, kalus tersebut berumur 2 minggu setelah proses transformasi gen Hd3a.
48 Gambar 14. Kalus padi hitam hasil transformasi pada medium MS2D dengan antibiotik kanamisin dan hygromisin 50 mg/l. ket :A. Kalus padi hitam Pakem; B. Kalus padi hitamIndmira; C. Kalus padi hitamKulon Progo; D. Kalus padi hitamSleman. Kalus berumur 2 minggu setelah proses transformasi gen Hd3a. Pada gambar A sudah terlihat adanya pertumbuhan akar pada kalus hasil transformasi (transforman).
Berbeda dengan sel kalus non transforman (wildtype) sebagai kontrol, apabila ditumbuhkan pada medium seleksi dengan penambahan antibiotik yang sama yaitu higromisin dan kanamisin dengan konsentrasi masing-masing 50 mg/L, tampak sel kalus non transforman mengalami pencoklatan (Gambar 15). Kalus terlihat mengalami kematian secara perlahan umur satu minggu pada medium seleksi ini.
A B
49 Gambar 15. Kalus padi hitamnon transforman. Pada medium MS2D dengan antibiotik higromisin dan kanamisin (masing-masing 50 mg/L). Kalus mengalami pencoklatan dan menuju kematian pada minggu pertama.
Penggunaan antibiotik higromisin dan kanamisin sangat menentukan kandidat sel kalus transforman (Yu et. al., 2001). Berdasarkan hasil yang diperoleh, sel kalus transforman yang tumbuh pada medium seleksi sebagian ada yang mengalami kematian dan sebagaian lagi tetap berwarna putih. Hal ini mengindikasikan bahwa beberapa kalus yang mampu tumbuh dengan baik pada medium seleksi merupakan kalus yang berhasil tertransformasi dengan gen Hd3a oleh bakteri Agrobacterium tumefaciens. Sedangkan kalus yang tidak mampu tumbuh pada medium seleksi mengindikasikan bahwa kalus tersebut tidak berhasil tertransformasi gen Hd3asehingga tidak memilki gen HPT yang dapat meregulasi higromisin didalam medium.Akibatnya kalus yang tidak tertansformasi gen Hd3apada medium seleksi mengalami kematian seperti pada kalus non transforman (wildtype) yang ditumbuhkan pada medium seleksi yang sama (Gambar 15). Antibiotik kanamisin dan higromisin dalam mediumberfungsi menghambat sintesis protein dalam organela terutama kloroplas sehingga terjadi
50 vitrifikasi disusul dengan kematian sel kalus (Slater et al.,2003). Tanaman yang dapat tumbuh (transforman) resisten terhadap kanamisin dan higromisin dikarenakan telah memiliki genHd3ayang berasal dari T-DNA Agrobacteriumtumefaciens.
DNA genom sel kalus yang hidup pada media seleksi (transforman) selanjutnya diisolasi yang kemudian dianalisis T-DNA yang terintegrasi pada DNA genom kalus transforman tersebut. Analisis dilakukan dengan metode PCR menggunakan primer spesifik untuk gen rolC::Hd3a dan gen HPT. Berikut adalah gambar keberadaan gen Hd3a dalam kalus padi transforman disajikan pada gambar 16.
A B C D E
Gambar 16. Elektroforegram DNA hasil amplifikasi DNA genom transforman padi hitam. Ket: A. Kalus padi hitam non transforman; B. Kalus padi hitam Pakem; C. Kalus padi hitamKulon Progo; D. kalus padi hitamIndmira; dan E. Kalus padi hitamSleman; M: marka gen; NT: kalus nontransforman; T: hasil amplifikasi genom kalus transgenik dengan primer Hd3a (174 bp); H: hasil amplifikasi genom kalus transgenik dengan primer HPT (455 bp).
M NT H T1 H1 T 2 H2 T3 H3 T4 H4
174 bp 455 bp
51 Analisis gen Hd3a pada genom kalus transforman dilakukan untuk mengetahui positif atau tidaknya keberadaan gen Hd3a dan HPT (Hygromysin phosfotransferase). Gen tersebut terdapat dalam genom tanaman kalus padi hitam yang telah ditransformasi. Pengecekan gen ini dilakukan dengan menggunakan primer spesifik yaitu pasangan primer Hd3a-F (forward) dan Hd3a-R (reverse). Amplifikasi dengan primer tersebut dihasilkan pita DNA sepanjang 174 bp. Sedangkan untuk gen HPT digunakan pasangan primer higromisin-F (forward) dan higromisin-R (reverse). Amplifikasi dengan primer hpt ini dihasilkan pita DNA sepanjang 455 bp.
Berdasarkan hasil analisis tersebut dapat diketahui bahwa kaluspadi hitam Pakem, Kulon Progo, Indmira, dan Sleman(B, C, D, E) telah berhasil ditransformasi oleh bakteri Agrobacterium tumefaciens yang membawa kontrakrolC::Hd3a-GFP.Hal ini terlihat adanya pita DNA pada hasil amplifikasi primer Hd3a yaitu 174 bp dan pita DNA hasil apmplifikasi primer HPT sepanjang 455 bp.Berbeda dengan genom kalus Non Transforman (A) yang tidak terlihat adanya band Hd3adan HPT apabila diamplifikasi dengan primer yang sama. Selain itu, berdasarkan uji pada medium seleksi dengan menggunakan antibiotik kanamisin dan higromisin terdapat beberapa kalus yang hidup yang mengindikasikan kalus ttersebut telah tersisipi oleh T-DNA yang mengandung konstrak gen rolC::Hd3a dan gen HPT yang dapat dilihat pada Gambar 14.
Kalus transforman yang telah diseleksi pada medium seleksi antibiotik selanjutnya dipindahkan pada medium regenerasi (Re) untuk diinisiasi menjadi shootdan rootsampai dengan terbentuknya tanaman baru (planlet). Dari penelitian
52 yang telah dilakukan, hanya padi hitamSleman yang dapat menunjukan keberhasilan transformasi genetik sampai dengan tumbuhnya shoot dan root. Hal ini dapat terlihat pada Gambar 17berikut ini.
Gambar 17. Kalus transforman padi hitam Sleman yang telah mengalami pertumbuhan
Shoot(bagian yang dilingkari). Pertumbuhan kalus selama 2 minggu pada medium
Regenerasi (Re).
Padi hitam Sleman yang berhasil sampai tahap regenerasi menjadi shoot (inisiasi pembentukan shoot)dikarenakan tidak adanya kontaminasi seperti pada kalus yang lain. Sementara itu, untuk padi hitam Pakem keberhasilan transformasi hanya sampai pada pembentukan akar.Pengulangan transformasi pada
53 hitamPakem tidak dilakukan karena biji padi hitam Pakem sudah habis digunakan untuk penelitian ini dan sulit untuk didapatkan kembali benihnya.Padi hitam Kulon Progo dan Indmira juga telah berhasil ditransformasi, namun mengalami kontaminasi kapang, sehingga tidak memungkinkan untuk dipertahankan.
Keberhasilan transformasi genetik pada hitam Sleman sampai tahap inisiasi pembentukan shoot perlu dilanjutkan untuk pembentukan akar dan pada akhirnya sampai pada aklimatisasi planlet. Planlet yang terbentuk diharapkan merupakan padi hitam transforman yang mengandung insert gen Hd3a yang nantinya memiliki fenotip cepat berbunga. Penelitian ini, diharapkan dapat digunakan sebagai dasar untuk penelitian lanjutan pada perakitan padi hitam yang cepat berbunga dimasa mendatang.