3.3 Metode yang digunakan
3.3.3 Analisis proksimat
Analisis proksimat merupakan suatu analisis yang dilakukan untuk memprediksi komposisi kimia suatu bahan, termasuk di dalamnya analisis kadar air, abu, lemak, protein, abu larut asam dan serat.
1) Analisis kadar air (AOAC 2005)
Tahap pertama yang dilakukan untuk menganalisis kadar air adalah cawan porselen dikeringkan dalam oven pada suhu 105 oC selama 1 jam.Cawan tersebut diletakkan ke dalam desikator (kurang lebih 15 menit) dan dibiarkan sampai dingin kemudian ditimbang.Sebanyak 5 gram contoh dimasukkan ke dalam cawan tersebut dan dikeringkan dengan oven pada suhu 105oC selama 5 atau hingga beratnya konstan.Setelah selesai proses pengeringan, cawan tersebut didinginkan dalam desikator ±30 menit dan dibiarkan sampai dingin kemudian ditimbang kembali.
Perhitungan kadar air :
% Kadar air = B - C x 100% B - A
Keterangan : A = Berat cawan kosong (gram)
B = Berat cawan yang diisi dengan sampel (gram)
C = Berat cawan dengan sampel yang sudah dikeringkan (gram) 2) Analisis kadar abu (AOAC 2005)
Cawan pengabuan dikeringkan di dalam oven selama 1 jam pada suhu 105oC, kemudian didinginkan di dalam desikator dan ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan. Sampel sebanyak 5 gram dimasukkan ke dalam
cawan pengabuan dan dipijarkan di atas nyala api bunsen hingga tidak berasap lagi. Setelah itu dimasukkan ke dalam tanur pengabuan dengan suhu 600 oC sampai pengabuan sempurna, kemudian ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan.
Kadar abu ditentukan dengan rumus:
% Kadar abu = C - A x 100% B - A
Keterangan : A = Berat cawan porselen kosong (gram) B = Berat cawan dengan sampel (gram)
C = Berat cawan dengan sampel setelah dikeringkan (gram) 3) Analisis kadar protein (AOAC 2005)
Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi.Sampel ditimbang sebanyak 0,25 gram, kemudian dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl 100 ml, lalu ditambah0,25 gram selenium dan 3 ml H2SO4 pekat. Sampel didestruksi pada suhu 410oC sampai larutan jernih lalu didinginkan, kemudian ditambah 50 ml akuades dan 20 ml NaOH 40%, kemudian dilakukan proses destilasi. Hasil destilasi ditampung dalam labu Erlenmeyer 125 ml yang berisi campuran 10 ml asam borat (H3BO3) 2% dan 2 tetes indikator bromcherosol green-methyl red yang berwarna merah muda. Setelah volume destilat mencapai 200 ml maka proses destilasi dihentikan. Lalu destilat dititrasi dengan HCl 0,1 N sampai terjadi perubahan warna merah muda kemudian volume titran dibaca dan dicatat.
Kadar protein dihitung dengan rumus sebagai berikut :
% N = (ml HCl – ml blanko) x N HCl x 14,007 x 100% Mg contoh x faktor koreksi alat *
% kadar protein = %N x faktor konversi* *) Faktor konversi = 6,25
4) Analisis kadar lemak (AOAC 2005)
Sampel seberat 5 gram (W1) dimasukkan ke dalam kertas saring dan selanjutnya dimasukkan ke dalam selongsong lemak.Sampel yang telah dibungkus dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya (W2) dan disambungkan dengan tabung soxhlet.Selongsong lemak dimasukkan ke dalam
Tabung ekstraksi dipasang pada alat destilasi soxhlet, lalu dipanaskan pada suhu 40 ºC menggunakan pemanas listrik selama 6 jam.Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pada saat destilasi pelarut akan ditampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam oven pada suhu 105oC, setelah itu labu didinginkan dalam desikator sampai beratnya konstan (W3).
Perhitungan kadar lemak:
% Kadar lemak = (W3- W2) x 100% W3
Keterangan : W1 = Berat sampel (gram)
W2 = Berat labu lemak kosong (gram) W3 = Berat labu lemak dengan lemak (gram)
5) Analisis kadar abu tidak larut asam menurut SNI-2354.1-2010 (BSN 2010) Abu hasil pengukurankadar abu total dilarutkan dalam 25 ml HCl 10% dan didihkan selama 5 menit. Larutan kemudian disaring dengan kertas saring Whatman bebas abu dan dicuci dengan air suling sampai bebas klorida (dengan pereaksi AgNO3). Kertas saring kemudian dikeringkan dalam oven. Kertas saring yang sudah dioven kemudian dilipat dengan menggunakan sudip dan diletakkan di dalam cawan porselen yang telah ditimbang bobotnya.Cawan tersebut dibakar di ruang asam sampai tidak berasap.Cawan kemudian dimasukkan dalam pada suhu 600 ºC.Setelah dilakukan pengabuan, cawan lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Kadar abu tak larut asam dapat ditentukan dengan rumus:
x 100%
6) Analisis kadar serat kasar menurut SNI 01-2891-1992
Metode analisis kadar serat kasar yaitu sebanyak 2-4 gram sampel dilarutkan dengan 100 ml H2SO4 1,25% dan dipanaskan hingga mendidih kemudian didestruksi selama 30 menit dan ditambahkan 50 ml NaOH 1,25%, kemudian didihkan kembali. Tahap selanjutnya adalah disaring menggunakan kertas saring Whatman (ф:10 cm) dan dengan bantuan corong Buchner. Residu hasil saringan dibilas dengan 20-30 ml air mendidih sebanyak 3 kali. Residu didestruksi kembali dibilas dengan 100 ml NaOH 1,25% selama 30 menit.
Setelah itu disaring dengan cara seperti diatas dan dibilas berturut-turut dengan 25 ml H2SO4 1,25%; 2,5 ml air sebanyak 3 kali; dan 25 ml alkohol. Residu beserta kertas saring dipindahkan ke cawan porselin yang telah diketahui bobotnya dan dikeringkan dalam oven 130 oC selama 2 jam. Setelah dingin residu beserta cawanporselin ditimbang (A), dan dimasukkan dalam tanur 600 oC selama 30 menit, lalu didinginkan dan ditimbang kembali (B).
3.3.4 Ekstraksi bahan aktif
Tahap ini terdiri dari beberapa langkah, yaitu persiapan sampel dan ekstraksi bahan aktif. Pada tahap persiapan sampel, genjer yang telah diambil dari desa Cikarawang, Dramaga, Bogor dipreparasi kemudian dilakukan pengukusan. Genjer segar dan genjer yang telah mengalami pengukusan dikeringkan dengan panas matahari. Genjer yang telah dikeringkan tersebut kemudian dihancurkan dengan blender sehingga didapat tekstur yang halus. Tahap selanjutnya adalah ekstraksi bahan aktif. Metode ekstraksi yang digunakan adalah metode ekstraksi tunggal (Quinn 1988). Pelarut yang digunakan dalam penelitian ini yaitu etanol 96%.
Sampel genjer yang telah dihancurkan ditimbang sebanyak 20 gram dan dimaserasi dengan pelarut etanol 96% sebanyak 100 ml selama 24 jam.Hasil maserasi yang berupa larutan kemudian disaring dengan kertas saring Whattman 42 sehingga didapat filtrat dan residu.Filtrat yang diperoleh dievaporasi hingga pelarut memisah dengan ekstrak menggunakan rotary vacuum evaporator pada suhu 50 ºC. Berdasarkan proses ini maka akan diperoleh ekstrak etanol genjer segar, genjer yang mengalami pengukusan selama 3 dan 5 menit.
3.3.5 Uji fitokimia (Harborne 1984)
Uji fitokimia dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya komponen- komponen bioaktif yang terdapat pada ekstrak kasar genjer yang memiliki aktivitas antioksidan.Uji fitokimia meliputi uji alkaloid, uji steroid/triterpenoid, flavonoid, saponin, fenol hidrokuinon, Molisch, Benedict, Biuret dan Ninhidrin.Metode uji ini berdasarkan Harborne (1984).
a) Alkaloid
Sejumlah sampel dilarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat 2N kemudian diuji dengan tiga pereaksi alkaloid yaitu, pereaksi Dragendorff, pereaksi Meyer, dan pereaksi Wagner. Hasil uji dinyatakan positif bila dengan pereaksi Meyer terbentuk endapan putih kekuningan, endapan coklat dengan pereaksi Wagner dan endapan merah hingga jingga dengan pereaksi Dragendorff.
Pereaksi Meyer dibuat dengan cara menambahkan 1,36 HgCl2 dengan 0,5 gram KI lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 100 ml
dengan labu takar. Pereaksi ini tidak berwarna. Pereaksi Wagner dibuat dengan cara 10 ml akuades dipipet kemudian ditambah 2,5 gram iodin dan 2 gram kalium iodida lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 200 ml dalam labu takar. Pereaksi ini berwarna coklat. Pereaksi Dragendorff dibuat dengan cara 0,8 gram bismut subnitrat ditambah dengan 10 ml asam asetat dan 40 ml air. Larutan ini dicampur dengan larutan yang dibuat dari 8 gram kalium iodida dalam 20 ml air. Sebelum digunakan, satu volume campuran ini diencerkan dengan 2,3 volume campuran 20 ml asam asetat glasial dan 100 ml air. Pereaksi ini berwarna jingga.
b) Steroid/ triterpenoid
Sejumlah sampel dilarutkan dalam 2 ml kloroform dalam tabung reaksi yang kering. Lalu, ke dalamnya ditambah 10 tetes anhidrat asetat dan 3 tetes asam sulfat pekat. Terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau menunjukkan reaksi positif.
c) Flavonoid
Sejumlah sampel ditambah serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 ml amil alkohol (campuran asam klorida 37% dan metanol 95% dengan volume yang sama) dan 4 ml alkohol kemudian campuran dikocok. Terbentuknya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya flavonoid.
d) Saponin (uji busa)
Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan adanya saponin.
e) Fenol Hidrokuinon (pereaksi FeCl3)
Sebanyak 1 gram sampel diekstrak dengan 20 mlmetanol 70%. Larutan yang dihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambah 2 tetes larutan FeCl3 5%. Terbentuknya warna hijau atau hijau biru menunjukkan adanya senyawa fenol dalam bahan.
f)Uji Molisch
Sebanyak 1 ml larutan sampel diberi 2 tetes pereaksi Molish dan 1 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung. Uji positif yang menunjukkan adanya karbohidrat ditandai terbentuknya kompleks berwarna ungu diantara 2 lapisan cairan.
g) Uji Benedict
Larutan sampel sebanyak 8 tetes dimasukkan ke dalam 5 ml pereaksi Benedict. Campuran dikocok dan dididihkan selama 5 menit. Terbentuknya warna hijau, kuning, atau endapan merah bata menunjukkan adanya gula pereduksi.
3.3.6 Analisis antioksidan dengan metode DPPH (Salazar et al. 2009)
Analisis aktivitas uji aktioksidan dilakukan dengan menggunakan metode DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil). Ekstrak kasar genjer dari hasil ekstraksi tunggal menggunakan pelarut etanol dilarutkan dalam etanol.Uji aktivitas antioksidan dilakukan berdasarkan kemampuan sampel dalam mereduksi radikal bebas stabil DPPH. Larutan DPPH yang digunakan, dibuat dengan melarutkan kristal DPPH dalam pelarut etanol 1 mM. Pembanding yang digunakan adalah BHT.Sampel dan pembanding dipindahkan dalam microplate sebanyak 100 µl menggunakan pipet mikro dan ditambah 100 µl DPPH.Campuran diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 30 menit dan diukur absorbansinya dengan menggunakan
ELISA Reader. Aktivitas antioksidan dari masing-masing sampel dinyatakan dengan persen inhibisi, yang dihitung dengan rumus sebagai berikut:
% inhibisi = (A blanko – A sampel) x 100% A blanko
Nilai konsentrasi sampel (ekstrak ataupun antioksidan pembanding) dan persen inhibisinya diplot masing-masing pada sumbu x dan y pada persamaan regresi linear.Persamaan regresi linear yang diperoleh dalam bentuk persamaan
y = a + bx, digunakan untuk mencari nilai IC50 (inhibitor concentration 50%) dari masing-masing sampel dengan menyatakan nilai y sebesar 50 dan nilai x yang akan diperoleh sebagai IC50. Nilai IC50 menyatakan besarnya konsentrasi larutan sampel (ekstrak ataupun antioksidan pembanding) yang dibutuhkan untuk mereduksi radikal bebas DPPH sebesar 50%.