Pada tahap ini dilakukan analisis sensori dengan uji hedonik untuk menilai kesukaan panelis terhadap dua produk stik meliputi stik sukun kontrol dan stik sukun terpilih yaitu stik sukun hasil perlakuan blansir dan perendaman dalam larutan CaCl2 yang menghasilkan pengurangan kadar akrilamida tertinggi. Parameter sensori yang diujikan adalah warna, tekstur, aroma, rasa dan keseluruhan. Nilai kesukaan panelis dimulai dari skor 1 (sangat tidak suka) sampai skor 7 (sangat suka). Panelis yang digunakan dalam penilaian uji hedonik adalah panelis tidak terlatih sebanyak 69 orang.
Selain analisis sensori pada parameter warna juga dilakukan analisis obyektif chromameter. Skala yang digunakan dalam mengukur warna stik sukun terpilih adalah skala L*, a* dan b*. Chromameter yang digunakan adalah
chromameter Konica CR-310 Minolta. Sebelum mengukur sampel, chromameter
dikalibrasi terlebih dahulu dengan nilai Y, x, dan y pada penutup plat kalibrasi. Setelah dikalibrasi, sampel diukur warnanya di tiga titik permukaan. Data L* a*
b* diolah dan dihitung nilai ΔE, Hue, dan Saturation Index (SI) sampel dengan
rumus sebagai berikut (Hutchings 1999):
Keterangan:
ΔE = perubahan total warna
L*₀, a*₀, b*₀ = nilai L*, a*, dan b* kontrol
L*,a*, b* = nilai L*, a*, dan b* sampel SI = Saturation index atau nilai chroma (C)
Prosedur Analisis 1. Analisis Proksimat Bahan Baku
a. Kadar Air (BSN 1992)
Botol timbang dikeringkan di dalam oven pada suhu 105 ºC selama 15 menit, kemudian diletakkan di dalam desikator, didinginkan dan ditimbang. Sampel sebanyak 1–2 g ditimbang dengan seksama pada botol timbang tersebut. Botol timbang berisi sampel dikeringkan pada oven suhu 105 ºC selama 3 jam. Selanjutnya dimasukkan ke dalam desikator, didinginkan dan ditimbang hingga diperoleh bobot tetap.
Perhitungan kadar air ditentukan dengan rumus: Kadar air (%) = x 100% W -W W -W 1 2 3 2 Keterangan:
W1 = Berat botol timbang kosong (gram)
W2 = Berat botol timbang yang diisi sampel (gram)
20
b. Kadar Abu (BSN 1992)
Cawan porselen kosong dikeringkan di dalam oven pada suhu 105 ºC selama 15 menit. Cawan tersebut kemudian didinginkan dalam desikator. Timbang cawan porselin kering tersebut dan bobotnya dicatat. Sampel sebesar 2-3 g ditimbang dengan seksama dan dimasukkan ke dalam cawan porselen tersebut. Selanjutnya dibakar di atas kompor listrik sampai tidak berasap dan dimasukkan ke dalam tanur pada suhu pengabuan 550 ºC selama 6 jam (sampai pengabuan sempurna). Cawan dimasukkan ke dalam desikator dan dibiarkan sampai dingin kemudian ditimbang hingga tercapai bobot tetap. Perhitungan kadar abu ditentukan dengan rumus:
Kadar abu (%) = x 100% W W W 1 2 3 Keterangan:
W1 = Berat sampel sebelum diabukan (gram) W2 =Berat cawan porselen kosong (gram)
W3 = Berat cawan porselen dengan sampel setelah diabukan (gram) c. Kadar Protein (BSN 1992)
Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari destruksi, destilasi dan titrasi.
(a)Tahap Destruksi
Sampel ditimbang sebesar 0.51 g kemudian dimasukkan ke dalam labu destruksi. Sebanyak 2 g campuran selen (2.5 g serbuk SeO2, 100 g K2SO4
dan 30 g CuSO4.H2O) dan 25 mL H2SO4 pekat ditambahkan ke dalam tabung tersebut. Tabung yang berisi larutan tersebut dipanaskan diatas alat pemanas listrik sampai mendidih. Proses destruksi dilakukan sampai larutan berwarna jernih kehijau-hijauan, kemudian didinginkan.
(b)Tahap Destilasi
Sampel yang telah didestruksi, diencerkan dan dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL, lalu ditepatkan sampai tanda garis. Dipipet 5 mL larutan dan dimasukkan ke dalam alat penyuling, tambahkan 5 mL NaOH 30% dan beberapa tetes indikator PP. Sulingkan selama kurang lebih 10 menit, sebagai penampung, digunakan 10 mL larutan asam borat 2% yang telah dicampur indikator BCG:MM (5:1). Destilasi dilakukan sampai diperoleh berwarna hijau kebiruan.
(c)Tahap Titrasi
Titrasi dilakukan dengan menggunakan HCL 0.01 N sampai warna larutan di erlenmeyer berubah menjadi merah muda. Volume titran dibaca dan dicatat. Lakukan penetaban blanko.
Perhitungan kadar nitrogen ditentukan dengan rumus:
Kadar N (%) = x100% sampel mg FP x 14 x HCl N x ) blanko HCl mL -sampel HCl (mL Keterangan: FP = Faktor pengeceran Kadar protein = % N x 6.25
d. Kadar Lemak (BSN 1992)
Sebanyak 1-2 g sampel ditimbang, kemudian dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 200 mL. Ditambahkan 30 mL larutan HCl 25%, 20 mL aquades panas, beberapa batu didih dan aduk hingga homogen. Ditutup Erlenmeyer dengan corong dan dididihkan di atas pemanas listrik selama 15 menit dari mendidih. Hasil hidrolisis tersebut disaring dan dicuci dengan aquades panas sampai bebas Cl atau asam. Kertas saring yang berisi residu dikeringkan dalam oven suhu 105 ºC sampai kering, kemudian dimasukkan kedalam timbel yang telah dialasi dengan kapas. Sumbat timbel yang berisi sampel dengan kapas pada bagian atasnya, kemudian dimasukkan ke dalam soxtec yang telah dihubungkan dengan pinggan lemak dan telah diketahui bobot kosongnya. Ekstrak dengan 50 mL pelarut heksan (2/3 dari tinggi pinggan) selama 1 jam. Sulingkan pelarut lemak dan hasil ekstrak dikeringkan dalam oven pada suhu 105 ºC selama 1 jam, didinginkan dalam desikator selama 30 menit lalu ditimbang sampai bobot tetap.
Perhitungan kadar lemak ditentukan dengan rumus: Kadar lemak (%) = 1 2 3 W W -W x 100% Keterangan:
W1 = Berat sampel (gram)
W2 = Berat pinggan lemak tanpa lemak (gram)
W3 = Berat pinggan lemak + lemak setelah ekstraksi (gram) e. Kadar Karbohidrat
Kadar karbohidrat ditentukan dengan cara by difference, yaitu hasil pengurangan dari 100% dengan kadar air, kadar abu, kadar lemak, dan kadar protein. Perhitungan kadar karbohidrat ditentukan dengan rumus:
Karbohidrat (%) =100% – % (kadar air+kadar abu+kadar lemak+kadar protein)
2. Analisis Kadar Pati (BSN 1992)
Ditimbang dengan seksama sampel sebanyak 5 g, dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 500 mL, kemudian ditambahkan 200 mL HCl 3%, didihkan selama 3 jam dengan pendingin tegak. Dinginkan dan dinetralkan dengan NaOH 30% (menggunakan kertas lakmus), ditambahkan sedikit CH3COOH 3% agar suasana larutan sedikit asam. Dipindahkan isinya ke dalam labu ukur 500 mL, ditambahkan aquades sampai tanda batas kemudian disaring. Dipipet 10 mL hasil saringan, dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 500 mL, ditambahkan 25 mL larutan luff schoorl dan beberapa butir batu didih serta 15 ml air suling. Dipanaskan campuran tersebut dengan pendingin tegak, usahakan agar larutan dapat mendidih dalam waktu 3 menit, didihkan terus selama 10 menit, kemudian diidnginkan dengan cepat dalam bak berisi es. Tambahkan 15 mL larutan KI 20% dan 25 mL larutan H2SO4 25%. Dititrasi secepatnya dengan larutan Na2S2O3 0.1 N menggunakan indikator kanji 0.5%. Dilakukan penetapan blanko.
22 Volume Na2S2O3 0.1 N (ml) = 0.1 dipakai yang O S Na N x ) V -(Vb c 2 2 3
Kadar glukosa (%) = G x faktor pengenceran x 100% berat sampel (mg)
Keterangan:
Vb = Volume blanko (ml) Vc = Volume Na2S2O3 (ml)
G = Jumlah glukosa, fruktosa, gula invert (mg), dilihat dari Tabel 7 Kadar pati (%) = 0.90 x kadar glukosa
3. Analisis Gula Pereduksi (BSN 1992)
Sebanyak 2 g sampel yang telah halus ditimbang dan dimasukkan ke dalam labu ukur 250 mL, kemudian ditambahkan 50 mL aquades dan diaduk hingga homogen. Sebanyak 5 mL larutan Pb-asetat setengah basa ditambahkan, kemudian diaduk hingga homogen. Penambahan bahan penjernih diberikan tetes demi tetes sampai penetesan dari regensia tidak menimbulkan pengeruhan lagi. Aquades ditambahkan sampai tanda batas, dikocok sampai homogen dan disaring. Hasil saringan dipipet sebanyak 10 mL dan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer. Ditambahkan 15 mL aquades dan 25 mL larutan luff schoorl serta beberapa butir batu didih. Setelah ditambah batu didih, Erlenmeyer dihubungkan dengan pendingin tegak, kemudian didihkan diatas pemanas listrik dan diusahakan 3 menit sudah mendidih. Pendidihan larutan dipertahankan selama 10 menit. Selanjutnya segera didinginkan dalam bak berisi air es. Setelah dingin, campuran dalam Erlenmeyer ditambahkan 25 mL H2SO4 25% dan 15 mL KI 20%. Lalu dititrasi dengan larutan Na2S2O3 0.1N menggunakan larutan kanji 1% sebagai indikator sebanyak 2–3 mL. Titrasi diakhiri setelah terbentuknya warna putih susu. Penetapan blanko dilakukan dengan 25 mL aquades dan 25 mL larutan luff schoorl. Kadar gula pereduksi dalam sampel dapat dicari dengan mengetahui selisih volume titran pada titrasi blanko dan titrasi larutan sampel dalam mL, kemudian dengan menggunakan tabel luff schoorl, hitung kesetaraan selisih volume titran (natrium tiosulfaf 0.1 N) dalam mL dengan kadar gula invert dalam mg.
Volume Na2S2O3 0.1 N (mL) = 0.1 dipakai yang O S Na N x ) V -(Vb c 2 2 3
Kadar gula pereduksi (%) = G x faktor pengenceran x 100% berat sampel (mg)
Keterangan:
Vb = Volume blanko (mL) Vc = Volume Na2S2O3 (mL)
Tabel 7 Penentuan jumlah gula pereduksi dengan metode luff schoorl
Selisih volume (mL) Na2S2O3
0.1 N
Jumlah glukosa, fruktosa, gula invert
mg C6H12O6
Selisih volume (mL) Na2S2O3
0.1 N
Jumlah glukosa, fruktosa, gula invert
mg C6H12O6 1.0 2.4 13.0 33.0 2.0 4.8 14.0 35.7 3.0 7.2 15.0 38.5 4.0 9.7 16.0 41.3 5.0 12.2 17.0 44.2 6.0 14.7 18.0 47.1 7.0 17.2 19.0 50.0 8.0 19.8 20.0 53.0 9.0 22.4 21.0 56.0 10.0 25.0 22.0 59.1 11.0 27.6 23.0 62.2 12.0 30.3 24.0 -
4. Analisis Asam Amino Asparagin (Fisher et al. 2001) a. Preparasi Sampel
Sampel sebanyak 5 g ditimbang seksama dan dimasukkan kedalam tabung reaksi kaca bertutup, kemudian ditambahkan 10 mL HCL 6 N dan divortex hingga homogen. Selanjutnya sampel dihidrolisis dengan autoklaf pada suhu 110 ºC selama 8 jam. Sampel tersebut didinginkan pada suhu ruang, kemudian dinetralkan dengan NaOH 6 N hingga pH menjadi 6.5–7.5. Larutan timbal asetat 40% ditambahkan sebanyak 2.5 mL dengan perlahan sambil digoyang hingga tidak terbentuk endapan lagi. Kelebihan timbal asetat dihilangkan dengan penambahan asam oksalat 15% sebanyak 1.0 mL. Sampel dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL untuk ditepatkan sampai tanda tera menggunakan aquabides. Sejumlah 3 mL larutan yang jernih diambil dan disaring dengan millex 0.45 µm. Pengenceran dilakukan sebanyak 5 kali. Sampel 25 µL direaksikan dalam pereaksi OPA 475 µL, kemudian tepat setelah 3 menit diinjeksikan sebanyak 50 µL ke HPLC. b. Pembuatan Standar
Asam amino standar (18 jenis asam amino) masing-masing ditimbang sebanyak 10 mg dan dilarutkan dengan HCL 0.1 N dalam labu ukur 10 mL (larutan standar 1:1000 ppm). Sebanyak 100 µL diambil dari masing-masing larutan tersebut, kemudian dimasukkan ke dalam tabung kolonikal 15 mL. Sebanyak 50 µL diambil dan ditambahkan 950 µL pereaksi OPA. Selanjutnya tepat setelah 3 menit diinjeksikan sebanyak 50 µL ke HPLC dengan kondisi sebagai berikut:
Kolom : Eurospher 100-5 C18, 250 x 4.6 mm Eluen : A = buffer asetat 0.01 M pH 5.9
B = metanol : buffer asetat 0.01 M pH 5.9: THF (80:15:5) Laju alir : 1.5 mL/menit
Detektor : fluorescence
24
5. Analisis akrilamida pada stik sukun (Modifikasi Wang et al. 2013)
Analisis akrilamida pada stik sukun diukur dengan menggunakan HPLC. Pertama–tama dilakukan kondisi alat HPLC untuk menghasilkan pemisahan yang baik, yaitu kromatogram dari larutan standar akrilamida memiliki bentuk yang baik dan waktu retensi yang tidak terlalu lama. Pada tahapan clean up
sampel menggunakan dua jenis kolom SPE yaitu Oasis HLB 60 mg, 2 mL dan Bond Elut Accucat 200 mg, 3 mL.
a. Ekstraksi dan clean up sampel (Modifikasi Wang et al. 2013)
Sampel stik sukun (±100 g) dihancurkan dengan blender, kemudian digerus sampai halus dengan mortar. Sampel ditimbang sebanyak 1 g dan dimasukkan ke dalam tabung sentrifus 15 mL, kemudian ditambahkan 10 mL akuabides. Sampel dalam tabung sentrifus divortex selama 5 menit. Sampel ditambah larutan Carrez I dan II masing-masing 50 µL dan disentrifugasi pada kecepatan 7000 rpm selama 5 menit. Larutan Carrez I dan II dibuat dengan melarutkan 15 g kalium heksasianoferat dan 30 g seng sulfat masing masing dalam 100 mL air. Sebanyak 5 mL larutan jernih (lapisan atas) dipindahkan ke dalam tabung konical menggunakan labu ukur 5 mL. Ekstrak dikeringkan dengan freeze drying. Residu dilarutkan kembali dalam 2 mL akuabides dan dipindahkan ke dalam tabung eppendorf untuk disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 5 menit, kemudian disaring dengan menggunakan syring filter 0.45 µm. Selanjutnya dilakukan clean-up
dengan kolom SPE.
Pada kolom SPE yang digunakan, terlebih dahulu dilakukan pengkondisian. Kolom SPE Oasis HLB dapat dikondisikan dengan mengelusikan 3.5 mL metanol kemudian 3.5 mL air (Wang et al. 2008). Hasil dari sampel yang telah diekstraksi dimasukkan ke dalam kolom SPE Oasis (eluan dibiarkan/dibuang). Elusi dilakukan dengan akuabides sebanyak 2.0 mL dan ditampung dalam tabung polipropilen sebagai eluat. Kolom SPE Bond Elut-Accucat dikondisikan dengan mengelusikan 2.5 mL metanol kemudian 2.5 mL air (Wang et al. 2008). Selanjutnya eluat hasil pembersihan dengan kolom SPE Oasis HLB, dimasukkan ke dalam kolom SPE Bond Elut-Accucat dan eluatnya langsung ditampung ke dalam botol vial 3 ml yang merupakan ekstrak sampel. Sebanyak 20 µL larutan diinjeksi ke dalam HPLC.
b. Kondisi analisis HPLC
Kondisi instrumen HPLC yang digunakan dapat dilihat pada Tabel 8. Tabel 8 Kondisi instrumen HPLC yang digunakan untuk analisis akrilamida
pada stik sukun
Parameter penggunaan HPLC Pengaturan
Jenis kolom Eurospher 100-5 C18-RP, 25 cm x 4.6 mm, 5 µm Fase gerak air : metanol (10:90, v/v)
Laju alir 1.2 mL/menit Sampel loop 20 L
Detektor PDA, Spectra System UV 60000 LP Panjang gelombang 210 nm
c. Penetapan kadar akrilamida
Kadar akrilamida di dalam sampel yang dinyatakan dalam (µg/kg) diperoleh dengan menghitung konsentrasi akrilamida menggunakan kurva standar (telah ditentukan sebelumnya), kemudian dimasukkan kedalam perhitungan berikut ini:
Kadar akrilamida (µg/kg) = Konsentrasi kurva standar (g/L) x vol larutan akhir (L) x FP x 1000
Berat sampel (g)
Volume larutan akhir = 2 mL = 0.002 L FP = faktor pengenceran = 2.02
Rancangan Penelitian
Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan empat faktor dan dua ulangan. Faktor perlakuan yaitu suhu blansir (A): A1=70 C dan A2=80 C; lama blansir (B): B1=5 menit dan B2=10 menit; konsentrasi CaCl2 (C): C1=0.04% dan C2 =0.08%; lama perendaman dalam larutan CaCl2 (D): D1= 15 menit dan D2=30 menit. Data yang diperoleh dianalisis menggunakan Analisis of Variance (ANOVA) pada taraf 5% dengan program SPSS versi 22 untuk mengetahui pengaruh perlakuan (4 faktor) terhadap kadar akrilamida dan persentase pengurangan kadar akrilamida dalam produk stik sukun. Data hasil analisis varian (ANOVA) yang menunjukkan nilai p < 0.05 (signifikan) pada
perlakuan, dilakukan uji lanjut Duncan’s untuk melihat ada atau tidaknya
perbedaan yang nyata pada masing-masing perlakuan.
Hasil analisis sensori dari uji hedonik dan hasil analisis obyektif pada parameter warna yang dihasilkan diolah dengan uji t pada taraf nyata 5% menggunakan program SPSS versi 22 untuk mengetahui tingkat kesukaan panelis terhadap stik sukun kontrol dan stik sukun terpilih.
26