BAHAN DAN METODE
2. Analisis Sifat Kimia
a. Kadar Air (Metode Gravimetri AOAC, 1995)
Cawan aluminium dikeringkan dalam oven pada suhu 105oC selama 15 menit, didinginkan dalam desikator lalu ditimbang (A). Sampel ditimbang sebanyak 5 g (B), kemudian cawan berisi sampel dikeringkan dalam oven pada suhu 105o
Kadar air (%) = B – (C – A) x 100% (C – A)
C selama 6 jam kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang hingga diperoleh bobot tetap (C). Kadar air dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
b. Kadar Protein (Metode Kjeldal AOAC, 1995)
Sampel puree buah sebanyak 0.5-3 g dimasukkan ke dalam labu kjelda ditambahkan 1.9 ± 0.1 K2SO4, 40 ± 10 mg HgO dan 2.0 ± 0.1ml H2 SO4 pekat, kemudian didestruksi dengan pemanasan sampai larutan berwarna jernih. Larutan hasil destruksi diencerkan dan didestilasi dengan penambahan 8 – 10 ml NaOH-Na2S2O3. Destilat ditampung
dalam 5 ml larutan H3BO3
Total Nitrogen (%) = (ml HCl – ml blanko) x N HCl x 14.007 x 100% Bobot contoh (mg)
Kadar protein (%) = Total nitrogen (%) x 6.25
dan 2-4 tetes indicator (campuran 2 bagian metil merah 0.2% dalam alkohol dan 1 bagian metilen blue 0.2% dalam alkohol). Kemudian dilakukan destilasi sampai tertampung kira-kira 50 ml destilat dalam erlenmeyer, lalu dititrasi dengan HCl 0.02 N sampai terjadi perubahan warna menjadi abu-abu. Hasil titrasi ini total nitrogen dapat diketahui, kadar protein contoh dihitung dengan mengalikan total nitrogen dengan faktor konversi:
c. Kadar Lemak (Metode Ekstraksi Soxhlet AOAC, 1995)
Labu lemak yang ukurannya sesuai dengan alat ekstraksi soxhlet dikeringkan dalam oven (1100C selama 1 jam). Kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang hingga bobot tetap. Sebanyak 5 g sampel dibungkus dengan kertas saring, kemudian ditutup dengan kapas wool yang bebas lemak. Kertas saring yang berisi sampel tersebut dimasukkan dalam alat ekstraksi soxhlet, kemudian dipasang alat kondenser diatasnya dan labu lemak dibawahnya.
Pelarut dietil eter atau petroleum eter dituangkan ke dalam labu lemak secukupnya sesuai dengan ukuran yang digunakan. Selanjutnya dilakukan refluks minimum 5 jam sampai pelarut turun kembali ke labu lemak berwarna jernih. Pelarut yang ada di dalam labu lemak didestilasi dan ditampung. Kemudian labu lemak yang berisi hasil ekstraksi dipanaskan dalam oven pada suhu 1050
d. Energi (AOAC, 1995)
C. Setelah dikeringkan sampai berat tetap lalu didinginkan dalam desikator dan dilakukan penimbangan labu beserta lemaknya hingga diperoleh bobot yang tetap.
Kadar Lemak (%) = berat lemak (g)/ berat sampel (g) x 100%
Kandungan energi dalam setiap 100 gr sampel dapat dihitung berdasarkan pada konversi angka energi. Energi dihitung dengan rumus: Energi (kkal) = 9 x g (lemak) + 4 x g (protein) + 4 x g (karbohidrat)
e. Serat Pangan (Metode Enzimatik, AOAC, 1995)
Sampel kering homogen diekstraksi lemaknya dengan petroleum eter selama 15 menit pada suhu kamar. Kemudian diambil 1 g dan dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer dan ditambahkan 25 ml 0.1M buffer Natrium fosfat pH 6.0 serta dicampur secara menyeluruh. Setelah itu ditambahkan 0.1 ml alfa amilase (Termamyl 120 L) dan labu ditutup dengan aluminium foil, kemudian diinkubasi selama 15 menit dalam penangas air panas (800C) bergoyang. Selanjutnya didinginkan lalu ditambahkan 20 ml air destilata, pH diatur menjadi 1.5 dengan HCl 0.1N dan elektroda dibersihkan dengan beberapa ml air. Kemudian ditambahkan pepsin 0.1g, ditutup dengan aluminium foil dan diinkubasi dalam penangas air bergoyang pada suhu 400C selama 1 jam, lalu ditambahkan 20 ml air destilata dan diatur pHnya menjadi 6 – 8 dengan NaOH, elektroda dibersihkan dengan beberapa ml air. Selanjutnya ditambahkan 0.1g pankreatin, kemudian labu ditutup dengan aluminium foil dan diinkubasi dalam penangas air bergoyang pada suhu 400C selama 1 jam dan pH diatur menjadi 4.5 dengan HCl 0.1N. Kemudian disaring dengan crucible lalu dicuci dengan 2x10 ml air destilata.
Residu/serat pangan tidak larut (IDF)
Residu dalam crucible dicuci dengan 2 x 10 ml etanol 95% dan 2 x 10 ml aseton. Crucibel dikeringkan pada suhu 1050C sampai bobot tetap (sekitar 12 jam) dan ditimbang setelah didinginkan dalam desikator (DI) kemudian diabukan dalam tanur pada suhu 5500
Volume filtrat diatur dan dicuci dengan air sampai 100 ml, ditambahkan 400 ml etanol 95% hangat (60
C minimal 5 jam, ditimbang setelah didinginkan dalam desikator (I1).
Filtrat/serat pangan larut (SDF)
0
C), didiamkan mengendap selama 1 jam. Kemudian disaring dengan crucible kering (porisitas 2) yang mengandung 0.5 g celite selanjutnya dicuci berturut-turut dengan 2x10 ml etanol 78%, 2x10 ml etanol 95% dan 2x10 ml aseton, setelah itu dikeringkan pada suhu 1050C semalam dan ditimbang setelah
didinginkan dalam desikator (D2), dan diabukan pada tanur 5500
% Serat pangan tidak larut (IDF) = D1 – I1 – B1 x 100% W
C minimal 5 jam, ditimbang setelah didinginkan dalam desikator (I2).
Dilakukan pula perhitungan serat blanko dengan menggunakan prosedur seperti diatas tetapi tanpa menggunakan sampel. Kadar serat pangan total dapat diperoleh dengan menggunakan rumus:
% Serat pangan yang larut (SDF) = D2 – I2 – B2 x 100% W
f. Penetapan Kadar Na, Ca, Fe dan Zn menggunakan AAS
Timbang sejumlah sampel yang mengandung 5-10 gram padatan dan masukkan kedalam labu Kjeldahl, lalu tambahkan 10 ml H2SO4 dan 10 ml (atau lebih) HNO3 dan beberapa buah batu didih. Selanjutnya panaskan perlahan-lahan sampai larutan berwarna gelap, hindari pembentukan buih yang berlebihan. Kemudian tambahkan 1 – 2 ml HNO3 dan lanjutkan pemanasan sampai larutan lebih gelap lagi. Lanjutkan penambahan HNO3
g. Analisis Total Asam (AOAC, 1995)
dan pemanasan selama 5 – 10 menit sampai larutan tidak gelap lagi (semua zat organik telah teroksidasi), kemudian dinginkan. Tambahkan 10 ml aquades (larutan akan menjadi tidak berwarna atau menjadi kuning muda jika mengandung Fe) dan panaskan sampai berasap. Diamkan larutan sampai dingin kembali kemudian tambahkan 5 ml aquades, didihkan sampai berasap. Selanjutnya dinginkan dan encerkan sampai volume tertentu.
Pindahkan larutan abu yang berasal dari pengabuan basah ke dalam labu takar. (pilih labu takar yang sesuai sehingga diperoleh konsentrasi logam yang sesuai dengan kisaran kerjanya). Tepatkan sampai tanda tera dengan aquades, campur merata, saring dengan Whatman 4,2. Filtrat yang diperoleh siap dibaca dengan AAS.
Sebanyak 10 gram buah dihancurkan dalam mortal dengan penambahan 100 ml aquades. Kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur
250 ml, diencerkan sampai tanda tera dengan aquades yang digunakan sebagai pembilas mortal. Contoh disaring, ambil 100 ml filtrat yang diperoleh dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Contoh tersebut ditambahkan 3 tetes phenolptalein dan dititrasi dengan NaOH 0,1 N sampai timbul warna merah jambu.
Perhitungan total asam dilakukan dengan rumus : Total asam =
b a
Keterangan :
a = jumlah NaOH 0.1 N untuk titrasi (ml) b = 100 gram bahan
h. Analisis Kadar Vitamin C (AOAC, 1995)
Kadar vitamin C ditentukan secara titrasi. Sebanyak 10 gram contoh dimasukkan ke dalam labu ukur 250 ml dan diencerkan sampai tepat tanda tera. Campuran dikocok dan kemudian disaring.
Filtrat sebanyak 25 ml ditambahkan dengan 1 ml tetes indikator kanji, lalu dititrasi dengan iod 0.01 N sampai timbul warna biru. Kandungan vitamin C dapat dihitung sebagai berikut :
A = V x 0.88 x P x 100 gram bobot contoh Keterangan :
A = kadar vitamin C (mg/100 gram bahan) V = jumlah iod 0,01 N untuk titrasi (ml) P = Jumlah pengenceran
0.88 = miligram asam askorbat untuk 1 ml iod 0.01 N i. Analisis Kadar Vitamin A (AOAC, 1995)
Sebanyak 5 – 10 gram contoh dicampur dengan 50 ml KOH 10% dalam etanol (10 gr KOH dilarutkan ke dalam etanol sampai 100 ml). Larutan selanjutnya direfluks selama 30 menit setelah itu disaring dengan kertas saring Whatman 40, dibilas dengan 50 ml etanol kemudian dicuci dengan petroleum eter sebanyak 3 x 50 ml. Masukkan kedalam corong pemisah, dibilas lagi dengan 50 ml petroleum eter, setelah itu dikocok dengan kuat. Selanjutnya diperoleh fraksi eter (atas) dan fraksi air (bawah). Fraksi air (bawah) terus diekstraksi sampai fraksi
eter tidak berwarna orange lagi. Fraksi eter (atas) yang diperoleh digabungkan kemudian dicuci dengan air sampai klorofil habis (fraksi air tidak berwarna hijau lagi) maka diperolehlah fraksi air dan fraksi eter. Fraksi eter selanjutnya dicuci dengan methanol 92% maka diperolehlan fraksi eter dan fraksi metanol (dibuang). Fraksi eter selanjutnya disaring dengan Whatman 42 melewati Na2SO4
Total karoten (ppm) = (x) x volume akhir sampel berat sampel (gram)
anhidrat. Filtrat yang diperoleh ditampung dalam labu ukur 50 ml, kemudian ditera dengan petroleum eter dan siap dibaca pada λ 450 nm. Dibandingkan dengan larutan standar.
Pembuatan Kurva Standar
Sebanyak 10 mg karoten murni ditera dalam 100 ml dengan menggunakan petroleum eter (100 ppm). Selanjutnya pipet 0.5 ml, 1.0 ml, 1.5 ml, 2.0 ml dan 2.5 ml larutan. Masing-masing larutan dicampur dengan petroleum eter maka diperolehlah 1 ppm, 2 ppm, 3 ppm, 4 ppm dan 5 ppm. Setelah itu dibaca pada λ 450 nm dan dikoreksi dengan blanko (petroleum eter).
Perhitungan:
Persamaan regresi kurva = Y = a + bx, maka (x) = (Y – a )/b
j. Pengukuran pH (pH meter)
Nilai pH diukur dengan pH meter tipe pH 2001. Sampel dimasukkan ke dalam gelas piala sebanyak 30-50 g sampel, kemudian elektroda pH meter dibilas dengan air destilata. Setelah itu, elektroda dikeringkan dengan tissue secara hati-hati. Elektroda dimasukkan ke dalam sampel. Lalu, nilai pH akan tertera pada layar. Setelah pengukuran selesai, elektroda dibilas dengan air destilata lalu dikeringkan dengan tissue dan letak kembali elektroda pada tempatnya.
k. Analisis Total Gula (Luff-Schoorl)
Menimbang bahan padat yang sudah dihaluskan atau bahan cair sebanyak 2,5 - 25 g tergantung kadar gula reduksinya, lalu pindahkan ke dalam labu takar 100 ml, tambahkan 50 ml aquadest. Selanjutnya tambahkan larutan Pb-asetat sebagai bahan penjernih tetes demi tetes sampai tidak menimbulkan pengeruhan lagi. Setelah itu, tambahkan aquades sampai tanda tera dan disaring.
Filtratnya ditampung dalam labu takar 200 ml. Untuk menghilangkan kelebihan Pb tambahkan Na-oksalat anhidrat secukupnya, kemudian ditambah aquades sampai tanda tera, digojog dan disaring. Selanjutnya diambil 25 ml filtrat bebas Pb yang diperkirakan mengandung 15 – 60 mg gula reduksi dan tambahkan 25 ml larutan Luff-Schoorl dalam erlenmeyer. Dibuat juga perlakuan blanko yaitu 25 ml larutan Luff-Schoorl dengan 25 ml aquades.
Selanjutnya ditambahkan beberapa butir batu didih. Erlenmeyer dihubungkan dengan pendingin balik, kemudian dididihkan. Diusahakan 2 menit sudah mendidih. Pendidihan larutan dipertahankan selama 10 menit. Selanjutnya cepat-cepat didinginkan dan ditambahkan 15 ml KI 20% dan dengan hati-hati tambahkan 25 ml H2SO4