C. METODE ANALISIS
2. Analisis Sifat Kimia
- Analisis Kadar Air, Metode Oven (AOAC, 1995)
Kadar air diukur dengan metode oven biasa karena kandungan bahan volatil pada sampel rendah dan sampel tidak mengalami degradasi pada suhu 100ºC. Pertama-tama, cawan alumunium kosong dikeringkan dalam oven dengan suhu 105°C selama 15 menit. Cawan tersebut lalu diangkat dan didinginkan dalam desikator selama 5 menit atau sampai cawan tidak terasa panas. Cawan yang telah dingin kemudian ditimbang dan dicatat beratnya. Setelah itu, sampel sebanyak 5 gram dimasukkan ke dalam cawan dan dikeringkan dalam oven pada suhu 105°C sampai beratnya konstan (perubahan berat tidak lebih dari 0,003 gram). Cawan tersebut lalu diangkat, didinginkan di dalam desikator, dan ditimbang berat akhirnya. Kadar air dapat dihitung dengan persamaan sebagai berikut:
Kadar air (% b/b) 100% a) -(x y) -(x × = Keterangan:
x = berat cawan dan sampel sebelum dikeringkan (g) y = berat cawan dan sampel setelah dikeringkan (g) a = berat cawan kosong (g)
- Analisis Kadar Abu (AOAC, 1995)
Cawan porselin dipanaskan di dalam tanur selama 15 menit kemudian didinginkan di dalam desikator. Setelah dingin, cawan ditimbang dan dicatat beratnya. Sampel sebanyak 5 g dimasukkan ke dalam cawan lalu diabukan di dalam tanur hingga diperoleh abu berwarna putih dan beratnya konstan. Pengabuan dilakukan dilakukan dalam 2 tahap yaitu tahap pertama suhu 400°C lalu dilanjutkan pada suhu 550°C. Cawan lalu diangkat, didinginkan dalam desikator, dan
Perhitungan: Kadar Abu (% b/b) 100% W W 1 2 × = Keterangan: W1 = Berat sampel (g) W2 = Berat abu (g)
- Analisis Kadar Protein, Metode Mikro Kjeldahl (AOAC, 1995) Sampel sebanyak ± 0,2 g (kira-kira membutuhkan 3-10 ml HCl 0,01N/0,02N) ditimbang dan dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl 30 ml. Lalu ditambahkan 2 gram K2SO4, 50 mg HgO, 2 ml H2SO4 pekat, dan batu didih. Sampel kemudian didekstruksi selama 1-1.5 jam hingga jernih dan didinginkan. Setelah itu, ditambahkan 2 ml air yang dimasukkan secara perlahan ke dalam labu dan didinginkan kembali. Cairan hasil dekstruksi (cairan X) dimasukkan ke dalam alat destilasi dan labu dibilas dengan air. Air bilasan juga dimasukkan ke dalam alat destilasi. Erlenmeyer 125 ml berisi 5 ml H3BO3 dan 2 tetes indikator (Methylen red : Methylen blue = 2:1) diletakkan di ujung kondensor alat destilasi dengan ujung selang kondensor terendam dalam larutan H3BO3. Cairan X ditambahkan 10 ml NaOH-Na2S2O3 dan destilasi dilakukan hingga larutan dalam erlenmeyer ± 50 ml. Larutan dalam erlenmeyer kemudian dititrasi dengan HCl 0,02 N. Titik akhir titrasi ditandai dengan perubahan warna larutan dari hijau menjadi abu-abu. Prosedur yang sama dilakukan juga untuk penetapan blanko.
Perhitungan: Kadar N (%) 100% W 14,007 C Vb) -(Vs × × × = Kadar protein (%) = % N x 5.95
Keterangan:
Vs = Volume HCl untuk titrasi sampel (ml) Vb = Volume untuk titrasi blanko (ml) C = Konsentrasi HCl (N)
W = Berat sampel (mg)
- Analisis Kadar Lemak, Metode Soxhlet (AOAC, 1995)
Labu lemak yang telah bebas lemak dikeringkan di dalam oven, didinginkan dalam desikator, dan ditimbang. Sampel sebanyak 5 g dibungkus dalam kertas saring kemudian ditutup kapas yang bebas lemak. Sampel dimasukkan ke dalam alat ekstraksi soxhlet, kemudian dipasang kondensor dan labu pada ujung-ujungnya. Lalu dimasukkan pelarut heksana ke dalam alat dan sampel direfluks selama 5 jam. Setelah itu, pelarut didestilasi dan ditampung pada tempat lain. Labu lemak dikeringkan di dalam oven pada suhu 105°C sampai diperoleh berat tetap. Labu lemak kemudian dipindahkan ke desikator untuk didinginkan, lalu ditimbang dan dicatat beratnya.
Perhitungan: Kadar Lemak (% b/b) 100% W W 1 2 × = Keterangan: W1 = Berat sampel (g) W2 = Berat lemak (g)
- Kadar Karbohidrat by difference (AOAC, 1995)
Pengukuran kadar karbohidrat menggunakan metode by difference dilakukan dengan cara:
Kadar karbohidrat (% bk)
b. Analisis Kadar Amilosa (Juliano, 1971 yang Dimodifikasi)
o Pembuatan Kurva Standar
Amilosa murni ditimbang sebanyak 40 mg kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml dan ditambahkan 1 ml etanol 95% dan 9 ml NaOH 1 N. Larutan standar kemudian didiamkan selama 24 jam dan ditepatkan sampai tanda tera dengan akuades. Selanjutnya larutan tersebut dipipet masing-masing sebanyak 1, 2, 3, 4, dan 5 ml lalu dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml. Ke dalam masing-masing labu takar tersebut ditambahkan juga asam asetat 1 N sebanyak masing-masing 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; dan 1 ml. Selanjutnya larutan tersebut juga ditambahkan larutan iod sebanyak 2 ml. Setelah itu, larutan ditepatkan sampai tanda tera dengan akuades dan dikocok, lalu didiamkan selama 20 menit. Larutan kemudian diukur intensitas warna yang terbentuk dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 620 nm.
o Penetapan Sampel
Sejumlah 100 mg sampel tanpa lemak dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml dan ditambahkan 1 ml etanol serta 9 ml NaOH 1 N. Setelah itu, larutan sampel didiamkan selama 24 jam dan ditepatkan sampai tanda tera dengan akuades. Larutan kemudian dipipet sebanyak 5 ml, lalu dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml dan ditambahkan 1 ml asetat 1 N serta 2 ml larutan iod. Larutan selanjutnya ditambah akuades sampai tanda tera, dikocok, didiamkan selama 20 menit, dan diukur intensitas warna yang terbentuk dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 620 nm. Kadar amilosa dihitung dengan rumus :
Kadar Amilosa (%) 100% W FP S A× × = Keterangan :
A = absorbansi sampel pada panjang gelombang 620 nm S = slope kemiringan pada kurva standar
FP = faktor pengenceran, yaitu 0,002 W = berat sampel (gram)
c. Analisis Kadar Serat Pangan , Metode Multienzim (Asp et al, 1983)
Sampel sebanyak 1 gram dimasukkan ke dalam erlenmeyer, kemudian ditambahkan 25 ml larutan buffer Na-phospat 0,1 M pH 6 dan diaduk agar terbentuk suspensi. Selanjutnya ditambahkan 0,1 ml enzim termamyl ke dalam erlenmeyer berisi sampel. Erlenmeyer lalu ditutup dengan alumunium foil dan diinkubasi dalam penangas air dengan suhu 100°C selama 15 menit sambil diaduk sesekali.
Sampel diangkat dan didinginkan, lalu ditambahkan 20 ml air destilata dan pH diatur menjadi 1,5 menggunakan HCl 4 N. Selanjutnya enzim pepsin sebanyak 100 mg ditambahkan ke dalam erlenmeyer berisi sampel, ditutup, dan diinkubasi dalam penangas air bergoyang pada suhu 40°C selama 1 jam. Erlenmeyer kemudian diangkat, ditambahkan air destilata, dan pH diatur menjadi 6,8 menggunakan NaOH. Setelah pH 6,8 tercapai, ditambahkan enzim pankreatin sebanyak 100 mg ke dalam erlenmeyer, erlenmeyer ditutup, dan diinkubasi dalam penangas air bergoyang pada suhu 40°C selama 1 jam. Persiapan tahap akhir adalah pengaturan pH menjadi 4,5 menggunakan HCl. Larutan sampel dengan pH 4,5 lalu disaring melalui crucible kering yang telah ditimbang beratnya (porositas 2) dan ditambahkan 0,5 gram celite kering (berat tepat diketahui). Pada penyaringan dilakukan 2 kali pencucian dengan 2 x 10 ml air destilata. - Residu (Serat pangan tidak larut)
Sampel dicuci dengan 2 x 10 ml etanol 95% dan 2 x 10 ml aseton. Sampel lalu dikeringkan dengan oven pada suhu 105°C selama satu malam atau hingga mencapai berat konstan. Sampel yang telah kering kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Setelah itu, sampel diabukan dengan tanur pada suhu 550°C selama 5 jam, didinginkan dalam desikator, dan ditimbang.
Filtrat tersebut kemudian disaring dengan crucible kering yang telah ditimbang beratnya (porositas 2) dan ditambahkan 0,5 gram celite kering (berat tepat diketahui). Filtrat lalu dicuci dengan 2 x 10 ml etanol 78%, 2 x 10 ml etanol 95%, dan 2 x 10 ml aseton. Selanjutnya filtrat dikeringkan dengan oven pada suhu 105°C selama satu malam atau hingga mencapai berat konstan. Filtrat lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Setelah itu, filtrat diabukan dengan tanur pada suhu 550°C selama 5 jam, didinginkan dalam desikator, dan ditimbang.
- Blanko
Penetapan blanko dapat dilakukan dengan cara yang seperti prosedur untuk sampel, tetapi dilakukan tanpa penambahan sampel. Perhitungan :
% Serat pangan tidak larut (IDF) 100% sampel Berat ) B -I -(D1 1 1 × =
% Serat pangan larut (SDF) 100%
sampel Berat ) B -I -(D2 2 2 × =
% Total Serat (TDF) = (SDF + IDF) (%) Keterangan :
D = Berat setelah pengeringan (gram) I = Berat setelah pengabuan (gram)
B = Berat blanko bebas abu (gram) = (D-I)blanko
d. Analisis Daya Cerna Pati In vitro (Muchtadi et al, 1992 yang Dimodifikasi)
Sampel dibuat suspensi dalam aquades (1%), kemudian dipanaskan dalam penangas air selama 30 menit pada suhu 90°C. Setelah itu, sampel didinginkan dan diambil sebanyak 2 ml kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Sebanyak 3 ml aquades dan 5 ml buffer Na-Fosfat 0,1 M juga ditambahkan ke dalam tabung reaksi, lalu diinkubasi pada suhu 37°C selama 15 menit, dan didinginkan. Setelah dingin, ke dalam tabung reaksi
ditambahkan larutan enzim amilase yang telah dilarutkan dalam buffer Na-Fosfat 0,05 M. Larutan tersebut kemudian diinkubasi kembali pada suhu 37°C selama 30 menit.
Sampel dipipet sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi lain. Setelah itu, ke dalam tabung reaksi ditambah 2 ml pereaksi dinitrosalisilat. Pereaksi dinitrosalisilat dibuat dengan melarutkan 1 gram 3,5-dinitrosalisilat, 30 gram Na-K tartarat, dan 1,6 gram NaOH dalam 100 ml aquades. Larutan tersebut kemudian dipanaskan pada suhu 100°C selama 10 menit sampai terbentuk warna oranye. Warna merah oranye yang terbentuk lalu diukur nilai absorbansinya pada panjang gelombang 520 nm. Kadar maltosa campuran reaksi dihitung menggunakan kurva standar maltosa murni yang diperoleh dengan mereaksikan larutan maltosa standar dengan pereaksi dinitrosalisilat menggunakan prosedur seperti di atas. Daya cerna pati beras dihitung sebagai berikut:
% Daya cerna pati = 100% b
a
×
Keterangan:
a = kadar maltosa sampel setelah reaksi enzimatis b = kadar maltosa pati murni setelah reaksi enzimatis
e. Analisis Kadar Pati Resisten (Englyst and Cumming, 1988 yang dikutip
oleh Marsono, 1993)
Sampel ditimbang sebanyak 100 mg, kemudian dimasukkan ke dalam tabung screw cap.
§ Ekstraksi gula
Larutan etanol 80 % sebanyak 10 ml dimasukkan ke dalam tabung screw cap. Tabung tersebut kemudian disentrifugasi pada kecepatan 2500 rpm dan suhu 4oC selama 25 menit. Supernatan yang terbentuk lalu
Erlenmeyer dan ditera sebagai gula sederhana menggunakan Analisis gula reduksi secara spektrofotometri. Padatan dalam tabung ditambahkan 5 ml aseton lalu dikeringkan dengan aliran gas N2.
§ Ekstraksi lemak (jika kadar lemak sampel lebih dari 5 %)
Padatan di dalam tabung ditambahkan dengan 8 ml heksana atau petroleum eter. Tabung tersebut kemudian divortex dan dilanjutkan dengan sentrifugasi selama 15 menit. Supernatan yang terbentuk dibuang. Sedangkan padatannya ditambahkan dengan 2-3 ml aseton lalu dikeringkan dengan aliran gas N2.
§ Hidrolisis pati
Padatan di dalam tabung ditambahkan dengan 7,5 ml buffer Na-asetat 0.1 M pH 5.0, 1.5 ml akuades, dan magnetic flea. Selanjutnya dilakukan proses gelatinisasi pada suhu 100oC selama 30 menit menggunakan penangas air yang dilengkapi dengan magnetic stirrer. Enzimα-endoamilase dimasukkan ke dalam tabung. Tabung lalu ditutup dan diinkubasi pada suhu 95oC selama 30 menit sambil diaduk menggunakan magnetic stirrer. Setelah didinginkan, amiloglukosidase sebanyak 200 µl dan 50 µl pullulanase dimasukkan ke dalam tabung. Tabung ditutup dan distirer pada suhu 40oC selama satu malam. Setelah satu malam, larutan dipanaskan dalam air mendidih selama 15 menit. Pemanasan tersebut bertujuan menginaktifasi enzim.
§ Presipitasi TDF dan RS
Larutan di-evapomix sampai volumenya kurang dari 4 ml. Kemudian ke dalam larutan ditambahkan 24.6 ml etanol 93% dan didiamkan selama satu malam dalam ruang dingin (suhu 4-10oC) untuk mendapatkan TDF dan RS. Tabung lalu disentrifugasi pada kecepatan 2500 rpm dan suhu 4 oC selama 15 menit. Supernatan selanjutnya dipindahkan ke dalam Erlenmeyer. Proses ekstraksi dilakukan hingga
dua kali ulangan dengan penambahan 10 ml etanol 80%. Supernatan hasil ekstraksi dikumpulkan dalam Erlenmeyer dan ditera sebagai pati dengan menggunakan Analisis gula reduksi secara spektrofotometri. Padatan dalam tabung ditambah dengan 2-3 ml aseton lalu dikeringkan dengan aliran gas N2.
§ Hidrolisis RS
Padatan dalam tabung ditambah dengan 1.5 ml KOH 2 M dan di-stirer selama 30 menit pada suhu kamar. Selanjutnya dimasukkan 7.5 ml buffer Na-asetat 0.1 M pH 5.0 dan 50µl pullulanase, tabung lalu ditutup dan di-stirer pada suhu 40 oC selama satu malam. Setelah didiamkan selama satu malam, larutan dipanaskan di dalam air mendidih selama 15 menit. Hal tersebut bertujuan menginaktifasi enzim.
§ Presipitasi TDF
Larutan di-evapomix sampai volumenya kurang dari 4 ml. Kemudian ke dalam larutan ditambahkan 24.6 ml etanol 93% dan didiamkan selama satu malam dalam ruang dingin (suhu 4-10oC). Proses tersebut dilakukan untuk mengendapkan TDF. Tabung lalu disentrifugasi pada kecepatan 2500 rpm dan suhu 4 oC selama 15 menit. Supernatan selanjutnya dipindahkan ke dalam Erlenmeyer. Proses ekstraksi dilakukan hingga dua kali ulangan dengan penambahan 10 ml etanol 80%. Supernatan hasil ekstraksi dikumpulkan dalam Erlenmeyer dan ditera sebagai RS dengan menggunakan Analisis gula reduksi secara spektrofotometri. Padatan dalam tabung ditambah dengan 2-3 ml aseton lalu dikeringkan dengan aliran gas N2.