METODOLOGI PENELITIAN
B. METODE PENELITIAN
1. Penelitian Tahap I
1.2. Analisis Total Mikroba
Analisis total mikroba dilakukan dengan merujuk pada metode Bacteriological Analytical Manual (BAM) tahun 2001, dimana 1 ml sampel dipipet dari pengenceran yang dikehendaki ke dalam cawan petri. Sebanyak ± 12-15 ml media dituang ke dalam cawan petri kemudian cawan petri digerakkan secara hati-hati untuk menyebarkan sel-sel mikroba secara merata, yaitu dengan gerakan seperti angka delapan. Setelah agar membeku, cawan
24 diinkubasi dengan posisi terbalik pada suhu 35°C selama 48±2 jam. Setelah inkubasi, jumlah koloni yang tumbuh pada cawan dihitung berdasarkan metode Bacteriological Analytical Manual (BAM).
Perhitungan total mikroba dilakukan dengan berbagai ketentuan BAM (2001), antara lain:
a. Cawan yang normal berisi 25-250 koloni. Semua koloni dihitung termasuk titik yang berukuran kecil. Pengenceran dan jumlah koloni semua dicatat untuk setiap cawan.
b. Cawan yang berisi lebih dari 250 koloni dicatat sebagai TBUD (Terlalu Banyak Untuk Dihitung). Jika tidak ada koloni yang tumbuh maka ditulis kurang dari 1 kali pengenceran terendah.
c. Rumus perhitungan yang digunakan adalah:
Dimana: N = jumlah koloni per ml/ per gram produk Σ C = jumlah seluruh koloni yang dihitung
n1 = jumlah cawan pada pengenceran pertama n2 = jumlah cawan pada pengenceran kedua D = pengenceran pertama yang dihitung 1.3. Analisa Salmonella (BAM, 2007)
1.3.1. Pre enrichment (Pra Pengkayaan)
Sebanyak 25 gram sampel ditimbang dan dimasukkan ke dalam kantung plastik steril. Ke dalam plastik tersebut dimasukkan 225 ml Lactose Broth steril dan dihancurkan dengan menggunakan stomacher selama 120 detik. Sampel yang telah dihancurkan dipindahkan ke dalam erlenmeyer steril dan dibiarkan selama 60 ± 5 menit pada suhu ruang dalam keadaan tertutup kemudian diinkubasi selama 24 ± 2 jam pada suhu 35 ± 2°C.
25 1.3.2. Selective Enrichment (Pengkayaan Selektif)
Sebanyak 1 ml sampel dari Lactose Broth yang telah diinkubasi diinokulasikan ke dalam 10 ml Tetrathionate Broth (TTB) dan divorteks, kemudian diinkubasi pada suhu 35 ± 2°C selama 24 ± 2 jam.
Sebanyak 0.1 ml dari sampel yang sama diinokulasikan ke dalam 10 ml Rappaport Vassiliadis (RV) Broth dan divorteks, kemudian diinkubasi pada suhu 42 ± 2°C selama 24 ± 2 jam.
1.3.3. Isolasi Salmonella dengan agar selektif
Sampel yang telah diinkubasi pada masing-masing media pengkayaan selektif diambil satu ose dan digoreskan secara kuadran pada media Xylose Lysine Desoxycholate Agar (XLDA), Hektoen Enteric Agar (HEA), dan Bismuth Sulfite Agar (BSA). Sebelum digores, media pengkayaan selektif divorteks terlebih dahulu. Ketiga agar selektif tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 35 ± 2°C selama 24 ± 2 jam. Setelah inkubasi, dilihat apakah ada koloni tipikal yang tumbuh pada masing-masing agar. Ciri-ciri koloni tipikal Salmonella pada masing-masing agar sebagai berikut: a. Pada media HEA, koloni berwarna biru kehijauan, dengan atau tanpa
warna hitam di tengahnya, beberapa akan tampak sebagai koloni yang besar, berwarna hitam mengkilap di tengahnya atau tampak sebagai koloni yang semuanya berwarna hitam
b. Pada media XLDA, koloni berwarna merah muda dengan atau tanpa warna hitam di tengahnya, beberapa akan tampak sebagai koloni yang besar, berwarna hitam mengkilap di tengahnya atau tampak sebagai koloni yang semuanya berwarna hitam
c. Pada media BSA, koloni berwarna coklat, abu-abu atau hitam, kadang tampak berwarna kilau metalik. Sekeliling koloni biasanya akan berwarna coklat pada awalnya dan akan menjadi hitam dengan bertambahnya waktu inkubasi, yang disebut halo effect.
26 Apabila terdapat koloni tipikal yang tumbuh maka analisa dilanjutkan dengan uji biokimia awal dengan menggunakan Triple Sugar Iron Agar (TSIA) dan Lysine Iron Agar (LIA).
Jika koloni tipikal Salmonella tidak ada, dicari koloni Salmonella yang tidak tipikal sebagai berikut:
a. Pada media HEA dan XLDA, beberapa kultur Salmonella yang tidak tipikal memproduksi koloni kuning dengan atau tanpa warna hitam di tengahnya. Jika koloni yang tipikal tidak muncul setelah inkubasi 24 ± 2 jam, diambil 2 atau lebih koloni yang tidak tipikal tersebut.
b. Pada media BSA, beberapa galur yang tidak tipikal memproduksi koloni hijau dengan sedikit atau tanpa dikelilingi warna gelap pada media. Jika tidak terdapat koloni yang tipikal maka tidak diambil koloninya, tetapi diinkubasi lagi selama 24 ± 2 jam. Jika koloni yang tipikal belum muncul juga maka koloni yang tidak tipikal diambil setelah diinkubasi 48 ± 2 jam.
1.3.4. Uji Biokimia Awal
Koloni tipikal atau non tipikal yang tumbuh pada media Xylose Lysine Desoxycholate Agar (XLDA), Hektoen Enteric Agar (HEA), dan Bismuth Sulfite Agar (BSA), diinokulasikan menggunakan jarum ose steril pada agar miring TSI dengan menggores dan menusukkannya. Tanpa pembakaran lagi, jarum ose tersebut diinokulasikan pada LIA miring dengan cara ditusuk dua kali dan digoreskan. Karena reaksi lysine decarboxylation harus benar-benar anaerob, maka tusukan pada media LIA harus mempunyai kedalaman sedikitnya 4 cm.
Inkubasi media TSIA dan LIA miring dilakukan pada suhu 35 ± 2°C selama 24 ± 2 jam. Tabung ditutup secara longgar untuk memelihara kondisi aerobik pada waktu inkubasi dan mencegah produksi H2S berlebih. Reaksi spesifik Salmonella pada agar miring TSIA adalah bagian permukaan berwarna merah (reaksi basa), bagian dasar agar atau agar tusuk berwarna kuning (reaksi asam), dan memproduksi H2S (kehitaman
27 pada agar kadang hingga menutupi warna dasar agar) dengan atau tanpa memproduksi gas.
Reaksi spesifik Salmonella pada LIA miring adalah bagian permukaan dan dasar agar (agar tusuk) berwarna ungu (reaksi basa). Sebagian besar kultur Salmonella memproduksi H2S pada LIA miring sedangkan beberapa yang bukan kultur Salmonella menghasilkan reaksi warna merah bata pada media tersebut.
1.3.5. Uji Biokimia Lanjutan
Koloni spesifik Salmonella pada TSI agar miring diambil satu ose untuk digoreskan pada Nutrien Agar (NA) miring, lalu diambil kembali satu ose untuk diinokulasikan ke dalam Urea Broth 2 ml. Inokulasi pada NA digunakan untuk analisa API Test. Keduanya kemudian diinkubasi pada suhu 35 ± 2°C selama 24 ± 2 jam.
Setelah diinkubasi, dilihat reaksi pada tabung Urea Broth. Salmonella tidak merubah warna Urea Broth (reaksi negatif, warna tetap orange), sehingga apabila Urea Broth berubah menjadi warna merah muda maka koloni tersebut bukan Salmonella. Koloni yang diduga Salmonella analisanya dilanjutkan dengan API Test 20E dengan menggunakan inokulan yang tumbuh pada NA miring.
1.3.6. Uji Konfirmasi dengan Perangkat API 20E
Koloni tipikal pada media NA miring yang berasal dari TSIA dan LIA digores kuadran pada media NA cawan dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Koloni yang terpisah diambil (±3 koloni) dan dilarutkan ke dalam 5 ml garam fisiologis kemudian divorteks. Suspensi kultur tersebut dipipet dan diisikan ke dalam mikrotube (tabung-tabung mikro) strip API 20E dengan jumlah pengisian sesuai dengan kode tulisan mikrotube. Mikrotube dengan kode CIT, VP, dan GEL yang ditandai dengan kotak di sekelilingnya diisi dengan suspensi sampai bagian atas tube, sedangkan mikrotube dengan kode LDC, ODC, ADH, H2S dan URE diisi dengan suspensi sampai bagian bawah leher tube untuk kemudian dipenuhi dengan