SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2014
ii
RINGKASAN
ASWITA EMMAWATI. Kajian Antiinfeksi Isolat Bakteri Asam Laktat Asal Mandai. Dibimbing oleh SRI LAKSMI SURYAATMADJA, LILIS NURAIDA dan DAHRUL SYAH.
Probiotik didefinisikan sebagai mikroorganisme hidup yang jika dikonsumsi dalam jumlah yang cukup akan memberikan manfaat bagi kesehatan inangnya. Probiotik telah banyak digunakan dalam pengobatan dan pencegahan penyakit-penyakit yang disebabkan oleh infeksi bakteri enterik. Eksplorasi sumber-sumber probiotik dapat dilakukan pada pangan fermentasi tradisional, salah satu di antaranya mandai, untuk mencari isolat-isolat yang mempunyai sifat fungsional yang dapat meningkatkan kesehatan. Mandai merupakan pangan fermentasi yang terbuat dari dami atau bagian dalam kulit cempedak yang tidak dikonsumsi. Sejumlah isolat bakteri asam laktat sebelumnya telah diisolasi dari mandai, tetapi perlu dilakukan pengujian sifat dasar yang harus dimiliki sebagai kandidat probiotik.
Untuk memperoleh isolat bakteri asam laktat yang mempunyai khasiat dan manfaat yang unggul, maka perlu dilakukan seleksi lebih lanjut berupa skrining potensi probiotik. Tujuan penelitian ini pada tahap pertama adalah untuk melakukan isolasi dan karakterisasi bakteri asam laktat yang diisolasi dari mandai serta mengevaluasi potensinya sebagai probiotik. Tujuan tahap kedua adalah untuk mengevaluasi agregasi, adhesi terhadap sel HCT-116 dan kemampuan berkompetisi terhadap enteropatogen (Listeria monocytogenes ATCC 13932, Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) K1.1 dan Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 14028). Tujuan tahap ketiga adalah untuk mengevaluasi kemampuan Lactobacillus plantarum MB427 asal mandai sebagai antidiare terhadap Escherichia coli enteropatogenik (EPEC) secara in vivo.
Sampel mandai diperoleh dari beberapa industri rumah tangga di Kalimantan Timur, yang dibuat dengan kadar garam 5, 10 dan 15%. Delapan puluh lima isolat bakteri asam laktat diperoleh dari mandai pada hari ke-4, 8 dan 12 fermentasi dan dikaji sifat-sifat probiotiknya. Semua isolat menunjukkan toleransi yang baik terhadap pH rendah (pH 2.0) dengan penurunan jumlah sel hidup kurang dari dua log cfu/ml. Isolat bakteri asam laktat dapat tumbuh dengan adanya 0.5% garam empedu walaupun jumlah sel hidupnya menurun dibandingkan dengan jumlah sel hidup pada medium tanpa garam empedu. Penurunan jumlah isolat hidup kurang dari 1 log cfu/ml teramati pada 21 isolat. Sembilan belas isolat dapat mentoleransi pH 2.0 dan garam empedu 0.5% lebih baik daripada yang lain dengan total penurunan jumlah sel hidup kurang dari 1 log cfu/ml. Sebagian besar isolat (11 dari 19) yang mentoleransi pH rendah diperoleh dari fermentasi mandai hari ke-8. Isolat MC812 mempunyai sifat antimikroba yang baik terhadap semua patogen uji (Listeria monocytogenes ATCC 13932, Enterococcus faecalis ATCC 19433, Bacillus cereus ATCC 10876, Escherichia coli ATCC 25922 dan Salmonella typhimurium ATCC 14028). Sembilan isolat lain mempunyai sifat antimikroba yang baik terhadap 3 atau lebih patogen uji. Resistensi terhadap antibiotik bervariasi di antara isolat. Kesepuluh isolat
diidentifikasi sebagai Lactobacillus plantarum dengan API 50 CHL dan dikonfirmasi dengan real-time-PCR.
Empat strain L. plantarum MC805, MC807, MB411 dan MB427 memiliki kemampuan autoagregasi yang baik, di atas 50%, tetapi hanya dua strain, MC802 dan MC812, yang menunjukkan kemampuan koagregasi (di atas 25%) dengan semua enteropatogen yang diuji. Lima strain L. plantarum(MB427, MB411, MC807, MC805, MC802), menunjukkan kemampuan beradhesi terhadap sel HCT-116 di atas 60%, dengan adhesi tertinggi (74%) ditunjukkan oleh MB427 setelah 1 jam inkubasi pada 37oC. Semua patogen dapat menempel pada sel HCT-116 dengan persentase adhesi berkisar dari 51 sampai 62%.L. plantarum menunjukkan potensi untuk melakukan penggantian (displacement), berkompetisi dan mengeksklusi enteropatogen pada sel HCT-116, tetapi kemampuan tersebut bersifat spesifik untuk setiap strain L. plantarumdan setiap patogen. Strain L. plantarum menunjukkan kemampuan kompetisi, eksklusi dan penggantian terhadap EPEC lebih baik daripada S. Typhimurium dan L. monocytogenes.L. plantarum MB427 menunjukkan kemampuan penghambatan yang kuat terhadap tiga pathogen kecuali dalam menggantikan L. monocytogenes. Strain L. plantarum dengan kemampuan tertinggi untuk berkompetisi, mengeksklusi dan menggantikan EPECdan S. Typhimurium adalah MB427 dan MB411 serta MB427, MC802, dan MC805; secara berurutan.
Bakteri kandidat probiotik L. plantarum MB427 yang diberikan pada tikus dapat menurunkan jumlah kejadian, tingkat keparahan dan durasi diare dibandingkan dengan kontrol yang hanya diinfeksi EPEC. Tikus yang menerima L. plantarum MB427 7 hari sebelum sampai 7 hari setelah diinfeksi EPEC menunjukkan jumlah kejadian dan tingkat keparahan diare lebih ringan dibandingkan kelompok yang menerima L. plantarum MB427 bersamaan dengan sampai 7 hari setelah diinfeksi EPEC. Kandidat probiotik L. plantarum MB427 mampu bertahan melewati saluran gastrointestinal tikus dan dapat mempertahankan jumlahnya dibandingkan dengan kontrol.L. plantarum MB427 juga memperlihatkan kemampuan beradhesi dan berkolonisasi pada saluran gastrointestinal tikus (sekum dan kolon). Tidak ditemukan indikasi adanya kemungkinan L. plantarum MB427 bersifat invasif.Kelompok yang menerima L. plantarum MB427 7 hari sebelum sampai 7 hari setelah diinfeksi EPEC menunjukkan nilai IgA dan IgG lebih tinggi daripada kelompok yang mendapat probiotik bersamaan dengan sampai 7 hari setelah diinfeksi EPEC. Berdasarkan data yang diperoleh, pemberian L. plantarum MB427 dapat dipertimbangkan dalam mencegah dan mengurangi diare yang disebabkan oleh infeksi EPEC. Kata kunci: probiotik, mandai, antiinfeksi, Lactobacillus plantarum
iv
SUMMARY
ASWITA EMMAWATI. Study of Antiinfection Properties of Lactic Acid Bacteria Isolated from Mandai. Supervised by SRI LAKSMI SURYAATMADJA, LILIS NURAIDA and DAHRUL SYAH.
Mandai is a fermented product made of cempedak (Artocarpus champeden) dami. The research aims to isolate and characterize lactic acid bacteria isolated from mandai and to evaluate their probiotic potency, to assess for aggregation, adhesion to enterocyte-like HCT-116 cells and competition abilities of L. plantarum strains towards enteropathogens Listeria monocytogenes ATCC 13932, enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) K1.1 and Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 14028, to evaluate the abilities of L. plantarum MB427 from mandai as antidiarrheae agent towards enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) in vivo.
Mandai samples were collected from several home industries in East Kalimantan area made with 5, 10 and 15% salt contents. Eighty-five lactic acid bacteria (LAB) isolates were obtained from mandai on day 4, 8, and 12 fermentation and assessed for their probiotic properties. All isolates showed good tolerances towards low pH (pH 2.0) with the decrease of viable counts of less than 2 log cfu/ml. The LAB isolates could grow in the present of 0.5% bile salt although the viable counts decreased as compared to those in medium without bile salt. Reduction of viable counts less than 1 log cfu/ml was observed in 21 isolates. Nineteen isolates could tolerate pH 2.0 and 0.5% bile salt better than others with the total decrease in viable counts less than 1 log cfu/ml. Most of isolates (11 out of 19 isolates) which tolerate low pH were obtained from 8 days mandai fermentation. Isolate MC812 had good antimicrobial properties against Listeria monocytogenes ATCC 13932, Enterococcus faecalis ATCC 19433, Bacillus cereus ATCC10876, Escherichia coli ATCC 25922 and Salmonella typhimurium ATCC 14028. Ten isolates had good antimicrobial properties against at least 3 pathogens tested. Their resistance toward antibiotics varied between isolates. All isolates was identified as Lactobacillus plantarum with API 50 CHL and confirmed with real-time-PCR.
The aggregation study showed that four L. plantarum strains of MC805, MC807, MB411 and MB427 had good autoaggregation ability above 50%, but only two strains, MC802 and MC812, demonstrated coaggregation ability (above 25%) with all enteropathogens tested. Five strains of L. plantarum (MB427, MB411, MC807, MC805, MC802) showed the ability to adhere to HCT-116 cells above 60%, with the highest adhesion (74%) was performed by MB427 after 1 h incubation at 37oC. All pathogens were also able to adhere to HCT-116 cells with the adhesion percentage ranging from 51 to 62%. L. plantarum strains showed the potential to displace, compete, and exclude the enteropathogens on HCT-116 cells, but their abilities were specific for each L. plantarum strain and each pathogen. L. plantarum strains showed stronger competitive inhibition, exclusion and displacement towards EPEC than S. Typhimurium and L. monocytogenes. L. plantarumMB427strain showed strong inhibition abilities towards the three pathogens except in displacing of L. monocytogenes. L. plantarum strains with the highest ability to compete with, exclude and displace of EPEC and S.
Typhimurium were MB427 and MB411 strains; and MB427, MC802, and MC805 strains; respectively. These results suggest that L. plantarum strains isolated from “mandai” were promising as probiotic candidates acquired protection against certain enteropathogenic infection.
L. plantarum MB427 (1 x 109 cfu) feeding to Sprague-Dawley rats intragastrically once a day was able to decrease the incident, severity and duration of diarrhea compared with nonprobiotic feeding group. Preinfection feeding on rats decrease the diarrhea incident, duration and severity compared with postinfection feeding and EPEC group. Strain L. plantarum MB427 showed ability to survive accross rats gastrointestinal and was able to adhere and colonize the rats gastrointestinal tract (caecum and colon). There was no observed the possibility of invasive characteristic of L. plantarum MB427 strain. Preinfection feeding group showed IgA and IgG higher than postinfection feeding group. Overall results showed L. plantarum MB427 considered as probiotic candidate and had abilities as antidiarrhea towards EPEC infection on mice.