PENDAHULUAN Latar Belakang

RIWAYAT HIDUP

1 PENDAHULUAN Latar Belakang

Penyakit infeksi saluran pencernaan karena bakteri enteropatogen masih menjadi masalah besar bagi kesehatan masyarakat. Setiap tahun penyakit infeksi gastrointestinal bertanggung jawab terhadap kasus-kasus kematian dan masalah kesehatan di seluruh dunia. Diperkirakan lebih dari empat milyar kejadian diare terjadi setiap tahunnya di seluruh dunia, termasuk 2.2 juta kematian per tahun akibat infeksi patogen enterik (WHO 2008).

Pengobatan diare akibat infeksi bakteri enteropatogen umumnya dilakukan dengan menggunakan antibiotik. Penggunaan antibiotik secara berlebihan telah melahirkan strain-strain bakteri patogen yang resisten terhadap antibiotik. Menghadapi kekhawatiran munculnya pandemi resistensi antibiotik, salah satu pengobatan alternatif yang dipilih adalah penggunaan kelompok bakteri yang secara kompetitif mampu menghambat pertumbuhan bakteri patogen enterik dalam saluran pencernaan. Kelompok bakteri ini, secara awam disebut bakteri baik, dan lebih dik\enal sebagai bakteri probiotik (Sleator 2010).

Istilah probiotik awalnya digunakan sebagai antonim dari antibiotik. Probiotik didefinisikan sebagai mikroorganisme hidup yang jika dikonsumsi dalam jumlah yang cukup akan menguntungkan kesehatan inangnya (FAO/WHO 2002). Probiotik telah banyak digunakan dalam pengobatan dan pencegahan penyakit diare yang disebabkan oleh infeksi bakteri enteropatogen dan rotavirus, necrotizing enterocolitis (NEC) dan inflammatory bowel disease (radang perut) (Culligan et al. 2009; Vasiljevic dan Shah 2008). Probiotik yang telah banyak dikenal saat ini umumnya merupakan kelompok bakteri asam laktat, terutama dari genus Lactobacillus dan Bifidobacterium.

Bakteri asam laktat merupakan kelompok besar mikroorganisme yang secara alami terdapat pada banyak bahan pangan serta saluran gastrointestinal dan urogenital manusia dan hewan. Selama pertumbuhannya, bakteri asam laktat dapat memproduksi komponen metabolit, seperti asam organik, hidrogen peroksida, bakteriosin, dan komponen lainnya. Bakteriosin merupakan suatu péptida antimikroba yang dihasilkan bakteri asam laktat selama fase pertumbuhan eksponensial yang dalam jumlah yang cukup, dapat membunuh atau menghambat bakteri lain yang berkompetisi dalam ekologi yang sama (Vasiljevic dan Shah 2008).

Tidak hanya dalam menjamin keamanan produk, dalam fermentasi, bakteri asam laktat berperan dalam membentuk tekstur, flavor dan aroma. Selama fermentasi, nilai nutrisi pangan meningkat dengan terjadinya hidrolisis komponen pangan menjadi produk yang lebih mudah dicerna dan destruksi faktor-faktor antinutrisi. Sifat-sifat yang menguntungkan bagi kesehatan atau sifat fungsional juga telah dilaporkan pada bakteri-bakteri asam laktat yang diisolasi dari produk pangan, seperti mempersingkat durasi diare, memperbaiki metabolisme laktosa, menurunkan kolesterol, menurunkan risiko mutagenisitas dan karsinogenik, mengobati intoleransi laktosa, dan menstimulasi sistem imun (Reid et al. 2006; Vassiljevic dan Shah, 2008; Tamang et al. 2009; Lee et al. 2011, Saad et al. 2013).

Sifat fungsional bakteri asam laktat bersifat spesifik strain sehingga perlu dilakukan eksplorasi strain bakteri asam laktat yang unggul dalam sifat fungsional tertentu. Eksplorasi sumber-sumber bakteri asam laktat dapat dilakukan pada pangan fermentasi tradisional, seperti tauco, tempoyak, pikel, sawi asin, bekasam, mandai dan lain-lain (Rahayu, 2003), untuk mencari isolat-isolat yang mempunyai sifat fungsional yang dapat meningkatkan kesehatan. Isolat yang diperoleh dapat dipergunakan sebagai kultur starter pada pangan fermentasi sehingga akan menaikkan nilai tambah produk fermentasi menjadi bernilai fungsional.

Pangan yang diproses dengan fermentasi yang melibatkan bakteri asam laktat telah menjadi bagian dari khasanah kekayaan budaya tradisional kita. Salah satunya adalah makanan fermentasi khas masyarakat yang hidup di wilayah propinsi Kalimantan Tengah, Selatan dan Timur, yaitu mandai. Mandai merupakan makanan fermentasi yang dibuat secara tradisional dari dami buah cempedak (Artocarpus champeden), yaitu bagian buah yang tidak dimakan, yang telah dibersihkan dan direndam dalam larutan garam selama dua minggu. Mandai hasil fermentasi, dicuci, diberi bumbu dan dikonsumsi sebagai lauk teman nasi. Rasanya yang enak dan gurih serta teksturnya yang menyerupai daging membuat makanan ini digemari. Proses fermentasi mandai merupakan bagian dari upaya pengawetan makanan agar tersedia untuk waktu yang lama sekaligus upaya pemanfaatan limbah dari konsumsi buah cempedak. Mandai yang dibuat dengan baik, umumnya dapat bertahan hingga 1 tahun atau lebih.

Rahayu (2003) telah mengisolasi sembilan isolat bakteri asam laktat dari mandai cempedak. Berdasarkan homologi DNA, lima di antaranya diidentifikasi sebagai Lactobacillus plantarum, satu spesies diidentifikasi sebagai Lactobacillus sp. dan tiga yang lain adalah Pediococcus pentosaceus. Akan tetapi belum dilakukan karakterisasi terhadap bakteri-bakteri yang telah diisolasi dari mandai. Dalam penelitian ini, eksplorasi bakteri asam laktat pada mandai tidak hanya dilakukan pada produk akhir fermentasi, melainkan akan diperluas selama berlangsungnya proses fermentasi meliputi variasi kadar garam dan lama fermentasi sehingga diharapkan akan diperoleh strain-strain bakteri asam laktat yang lebih bervariasi. Karakterisasi terhadap isolat-isolat yang diperoleh meliputi sifat-sifat yang menunjukkan potensi dasar sebagai probiotik dan sifat-sifat fungsional lain yang diharapkan dimiliki oleh bakteri asam laktat, khususnya dalam pencegahan infeksi bakteri enteropatogen.

Perumusan Masalah

Sejumlah isolat bakteri asam laktat sebelumnya telah diisolasi dari mandai, tetapi perlu dilakukan pengujian sifat dasar yang harus dimiliki sebagai kandidat probiotik. Di samping itu, penelitian yang sudah dilakukan (Rahayu 2003) belum mengeksplorasi bakteri asam laktat asal mandai dengan berdasarkan keragaman konsentrasi garam selama fermentasi.Untuk memperoleh isolat bakteri asam laktat yang mempunyai khasiat dan manfaat yang unggul, maka perlu dilakukan seleksi lebih lanjut berupa skrining potensi probiotik. Pengujian antagonismenya terhadap bakteri enteropatogen (Listeria monocytogenes ATCC 13932, Enterococcus faecalis ATCC 19433, Bacillus cereus ATCC 10876, Escherichia coli ATCC 25922 dan

Salmonella typhimurium ATCC 14028) juga perlu dilakukan, termasuk mekanisme agregasi, adhesi dan kompetisi dalam menghambat bakteri enterik secara in vitro dengan menggunakan sel HCT-116. Pengujian efektivitas bakteri asam laktat asal mandai dalam mencegah atau mereduksi infeksi bakteri Enteropatogenic E. coli (EPEC) K1.1 perlu dilakukan secara in vivo. Bakteri asam laktat sebagai probiotik harus diketahui identitasnya secara molekuler sehingga terhadap spesies atau strain yang menunjukkan potensi probiotik perlu diidentifikasi secara molekuler.

Tujuan

Tujuan dalam penelitian ini adalah untuk memperoleh isolat-isolat bakteri asam laktat asal mandai yang mempunyai sifat-sifat fungsional yang dapat memberikan dampak positif terhadap kesehatan manusia, secara spesifik dalam pencegahan infeksi oleh bakteri enteropatogen, yang telah teruji melalui pengujian secara in vitro dan in vivo.

Tujuan spesifik dari penelitian ini adalah sebagai berikut:

1. Memperoleh isolat bakteri asam laktat dari mandai yang telah dikarakterisasi sifat-sifat dasar sebagai probiotik dan diidentifikasi dengan menggunakan metode biokimia dan molekuler

2. Mengetahui mekanisme antiinfeksi berdasarkan kemampuan agregasi isolat bakteri asam laktat terhadap 5 spesies bakteri enteropatogen serta kemampuan adhesi dan kompetisi pada kultur sel HCT-116

3. Mengetahui potensi antiinfeksi isolat bakteri asam laktat terpilih terhadap EPEC secara in vivo

Hipotesis

1. Terdapat beberapa isolat bakteri asam laktat asal mandai yang bersifat sebagai kandidat probiotik

2. Kandidat probiotik yang diisolasi dari mandai mempunyai aktivitas antagonistik terhadap salah satu atau lebih dari lima spesies bakteri enteropatogen yang diujikan

3. Kandidat probiotik yang diisolasi dari mandai mampu mencegah atau mengurangi adhesi lima jenis bakteri enteropatogen secara in vitro pada kultur sel

4. Kandidat probiotik yang diisolasi dari mandai mampu mencegah atau mengurangi dampak infeksi bakteri enteropatogen pada tikus

5. Kandidat probiotik yang diisolasi dari mandai mampu memodulasi respon imun pada tikus yang diinfeksi oleh bakteri enteropatogen

Manfaat

Diperolehnya isolat bakteri asam laktat kandidat probiotik yang sudah teridentifikasi secara molekuler dan memiliki sifat fungsional terhadap bakteri

enteropatogen dan telah teruji baik secara in vitro maupun in vivo. Hasil penelitian berupa kandidat probiotik diharapkan dapat diaplikasikan pada berbagai jenis pangan dalam rangka pengembangan pangan probiotik.

Ruang Lingkup Penelitian

Kegiatan ini dimulai dengan pengumpulan isolat dari produk fermentasi dami cempedak (mandai) dari wilayah Samarinda Kalimantan Timur. Sampel mandai sejumlah 45 sampel diperoleh dari Samarinda Kalimantan Timur, terdiri atas beberapa kelompok berdasarkan kadar garam (5, 10, 15%) dan waktu fermentasi (4, 8, 12 hari), masing-masing 5 sampel. Terhadap isolat yang diperoleh dilakukan pengujian ketahanan terhadap pH rendah dan ketahanan terhadap garam empedu untuk melihat kemampuan bertahan dalam saluran pencernaan manusia, aktivitas antimikroba terhadap patogen yang umum ditemukan pada saluran pencernaan (enteropatogen), seperti Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Escherichia coli dan Salmonella enterica serovar Typhimurium, serta resistensi terhadap antibiotik. Identifikasi isolat yang potensial akan dilakukan secara biokimia dengan kit API 50 CHL dan dikonfirmasi dengan qualitative PCR yang mengidentifikasi melalui analisis kurva pelelehan.

Lebih jauh pada tahap kedua, isolat terpilih dianalisis kemampuannya melakukan autoagregasi dan koagregasi.Analisis sifat fungsional lebih lanjut akan dilakukan secara in vitro menggunakan kultur sel HCT-116 untuk mengkaji kemampuan isolat melakukan adhesi pada sel usus serta kemampuan penghambatan adhesi dan kolonisasi bakteri enterik pada sel usus.

Pada tahap ketiga, secara in vivo dilakukan pemberian isolat kultur kandidat probiotik pada tikus yang telah diinfeksi EPEC. Analisis yang akan dilakukan adalah analisis imunologi, dan analisis mikrobiologi feses dan organ tikus. Tahapan dan rincian aktivitas yang dilakukan dalam tiap tahapan secara menyeluruh disajikan pada Gambar 1.1.

Daftar Pustaka

Culligan EP, Hill C, dan Sleator RD. 2009. Probiotics and gastrointestinal disease: Successes, problems, and future prospects. Gut Pathogens 1: 19.

[FAO/WHO] Food and Agricultural Organization/World Health Organization. 2002. Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food. Report of a Joint FAO/WHO Working Group on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food. Ontario, Canada

Lee. H.J., H.Yoon, Y.Ji, H.Kim, H.Park, J.Lee. 2011. Functional properties of Lactobacillus strains isolated from kimchi. Int J Food Microbiol 145:155- 161

Rahayu, E.S. 2003. Lactic acid bacteria in fermented foods of Indonesian origins. Agritech 23:75-84

Reid G, Kim SO, Köhler GA. 2006. Selecting, testing and understanding probiotic microorganisms. FEMS Immunol Med Microbiol 46(2):149-57

Saad N, Delattre C, Urdaci M, Schmitter JM, Bressolier P. 2013. An overview of the last advances in probiotic and prebiotic field. LWT 50: 1-16

Tamang, J.P., Tamang B., Schillinger U., Guigas C., Holzapfel W. H. 2009. Functional properties of lactic acid bacteria isolated from ethnic fermented vegetables of the Himalayas. Int J Food Microbiol 135: 26-33

Vasiljevic, T. dan Shah, N.P. 2008. Probiotics – From Metchnikoff to bioactive. International Dairy Journal 18: 414-728

[WHO] World Health Organization. 2008. The Global Burden of Disease: 2004 Update. World Health Organization Press, Geneva

Gambar 1.1. Tahapan, rincian aktivitas dan output untuk mencapai tujuan penelitian

Isolat-isolat bakteri asam laktat asal mandai yang telah diketahui identitasnya, berpotensi sebagai probiotik dan mampu mencegah diare

Kajian pertama:

Isolasi, karakterisasi dan identifikasi bakteri asam laktat asal mandai sebagai kandidat probiotik

Aktivitas

Isolasi bakteri asam laktat asal mandai Ketahanan terhadap pH rendah dan garam empedu

Aktivitas antimikroba terhadap patogen Resistensi terhadap antibiotik

Identifikasi secara biokimia molekuler dengan q-PCR Output Kandidat probiotik yang telah terkarakterisasi dan teridentifikasi Kajian kedua:

Kajian agregasi, adhesi dan kompetisi isolat bakteri asam laktat asal mandai

Aktivitas

Pengujian autoagregasi dan koagregasi Pengujian adhesi pada sel HCT-116

Pengujian kompetisi, eksklusi dan

displacement Output Kandidat probiotik yang telah dievaluasi sifat antiinfeksi secara in vitro Kajian ketiga:

Kajian antidiare kandidat probiotik asal mandai pada tikus yang diinfeksi EPEC

Aktivitas

Pemberian probiotik dan infeksi EPEC pada tikus

Pengujian total bakteri asam laktat dan E. coli feses dan organ tikus

Pengujian imunologi Output Kandidat probiotik yang telah dievaluasi sifat antiinfeksi EPEC secara in vivo

2 KARAKTERISASI ISOLAT BAKTERI ASAM LAKTAT DARI MANDAI – MAKANAN FERMENTASI TRADISIONAL DARI DAMI CEMPEDAK (Artocarpus champeden) YANG BERPOTENSI SEBAGAI

PROBIOTIK1

ABSTRAK

Mandai merupakan pangan fermentasi yang terbuat dari dami atau bagian dalam kulit cempedak yang tidak dikonsumsi. Penelitian tentang mandai, khususnya bakteri yang terlibat dalam fermentasi mandai, masih belum banyak dilakukan. Tujuan penelitian ini adalah untuk melakukan isolasi dan karakterisasi bakteri asam laktat yang diisolasi dari mandai, mengevaluasi potensinya sebagai probiotik serta mengidentifikasinya. Sampel mandai diperoleh dari beberapa industri rumah tangga di Kalimantan Timur, yang dibuat dengan kadar garam 5, 10 dan 15%. Delapan puluh lima isolat bakteri asam laktat diperoleh dari mandai pada hari ke-4, 8 dan 12 fermentasi dan dikaji sifat-sifat probiotiknya. Semua isolat menunjukkan toleransi yang baik terhadap pH rendah (pH 2.0) dengan penurunan jumlah sel hidup kurang dari dua log cfu/ml. Isolat bakteri asam laktat dapat tumbuh dengan adanya 0.5% garam empedu walaupun jumlah sel hidupnya menurun dibandingkan dengan jumlah sel hidup pada medium tanpa garam empedu. Penurunan jumlah isolat hidup kurang dari 1 log cfu/ml teramati pada 21 isolat. Sembilan belas isolat dapat mentoleransi pH 2.0 dan garam empedu 0.5% lebih baik daripada yang lain dengan total penurunan jumlah sel hidup kurang dari 1 log cfu/ml. Sebagian besar isolat (11 dari 19) yang mentoleransi pH rendah diperoleh dari fermentasi mandai hari ke-8 dan kadar garam 15%. Isolat MC812 mempunyai sifat antimikroba yang baik terhadap semua patogen uji (Listeria monocytogenes ATCC 13932, Enterococcus faecalis ATCC 19433, Bacillus cereus ATCC 10876, Escherichia coli ATCC 25922 dan Salmonella typhimurium ATCC 14028). Sembilan isolat lain mempunyai sifat antimikroba yang baik terhadap 3 atau lebih patogen uji. Resistensi terhadap antibiotik bervariasi di antara isolat. Kesepuluh isolat diidentifikasi sebagai Lactobacillus plantarum dengan API 50 CHL dan dikonfirmasi dengan qualitative-PCR. Keseluruhan hasil mengindikasikan bahwa kesepuluh bakteri asam laktat yang diisolasi dari mandai berpotensi sebagai probiotik.

Kata kunci: probiotik, bakteri asam laktat, sifat antimikroba, mandai, Lactobacillus plantarum

1. PENDAHULUAN

Kalimantan Tengah, Selatan dan Timur, yaitu Mandai. Mandai merupakan makanan fermentasi yang dibuat secara tradisional dari dami atau kulit buah cempedak bagian dalam yang telah dibersihkan dan direndam dalam larutan garam. Mandai yang telah jadi, dicuci, diberi bumbu dan dikonsumsi sebagai lauk teman nasi. Rasanya yang enak dan gurih serta teksturnya yang menyerupai daging membuat makanan ini digemari. Proses fermentasi mandai merupakan bagian dari upaya pengawetan makanan agar tersedia untuk waktu yang lama sekaligus upaya pemanfaatan limbah dari konsumsi buah cempedak. Mandai yang dibuat dengan baik, umumnya dapat bertahan hingga 1 tahun atau lebih.

Sebagai pangan fermentasi yang belum banyak dikenal, penelitian tentang mandai masih terbatas. Rahayu (2003) melakukan penelitian tentang mikroorganisme yang terlibat dalam pangan fermentasi tradisional Indonesia, salah satunya mandai, dan telah berhasil mengisolasi 9 bakteri dari mandai, di antaranya telah diidentifikasi sebagai Lactobacillus plantarum dan Pediococcus pentosaceus. Kedua bakteri ini tergolong dalam kelompok bakteri asam laktat. Proses fermentasi mandai berikut perubahan yang terjadi selama fermentasi telah diteliti oleh Nur (2009) meliputi kenaikan jumlah khamir dan bakteri asam laktat, penurunan kadar gula tereduksi, penurunan pH, dan kenaikan kadar garam produk selama fermentasi.

Bakteri asam laktat merupakan kelompok besar mikroorganisme yang secara fisiologis menghasilkan asam laktat sebagai metabolit utama. Kelompok ini secara alami terdapat pada banyak bahan pangan serta saluran gastrointestinal dan urogenital manusia dan hewan. Selama pertumbuhannya, bakteri asam laktat dapat memproduksi komponen metabolit, seperti asam organik, hidrogen peroksida, bakteriosin, dan komponen lainnya. Bakteriosin merupakan suatu peptida antimikroba yang dihasilkan bakteri asam laktat selama fase pertumbuhan eksponensial yang dalam jumlah yang cukup, dapat membunuh atau menghambat bakteri lain yang berkompetisi dalam ekologi yang sama (Vasiljevic dan Shah 2008).

Beberapa spesies dari kelompok bakteri asam laktat, terutama dari genera Lactobacillus and Bifidobacterium, telah dikarakterisasi sebagai probiotik. Probiotik didefinisikan sebagai mikrorganisme hidup yang jika dikonsumsi dalam jumlah cukup akan memberikan manfaat kesehatan bagi yang mengkonsumsinya (FAO/WHO 2002). Mikroorganisme probiotik memberikan manfaat terhadap kesehatan manusia, melindungi dari infeksi bakteri enteropatogen, menurunkan kejadian dan durasi diare, necrotizing enterocolitis (NEC) dan radang perut (Culligan et al. 2009; Vasiljevic dan Shah 2008).

Penyakit-penyakit gastrointestinal yang disebabkan oleh bakteri masih menjadi masalah besar dalam dunia kesehatan. Diperkirakan lebih dari 4 milyar kasus diare terjadi setiap tahun dan 2,2 juta di antaranya menyebabkan kematian (WHO 2008). Di Indonesia sendiri, diare menjadi penyebab 3,5% dari seluruh kematian penduduk. Untuk kelompok bayi dan balita, diare menjadi penyebab kematian tertinggi dengan proporsi 31,2% untuk bayi dan 25,2% untuk kelompok balita (Balitbangkes 2007). Terapi antibiotik telah digunakan untuk mengatasi infeksi bakteri pada saluran pencernaan manusia. Akan tetapi, meningkatnya resistensi antibiotik menjadi penyebab yang menyadarkan masyarakat terhadap penggunaan probiotik sebagai terapi alternatif untuk penyakit infeksi saluran pencernaan.

Probiotik mempunyai kemampuan untuk tumbuh secara kompetitif dengan bakteri enterik, sehingga dapat menghambat pertumbuhan bakteri enterik dalam saluran pencernaan manusia.

Sifat fungsional bakteri asam laktat bersifat spesifik strain sehingga masih perlu dilakukan eksplorasi strain bakteri asam laktat yang unggul dalam sifat fungsional tertentu. Eksplorasi sumber-sumber bakteri asam laktat dapat dilakukan pada pangan fermentasi tradisional, seperti tauco, tempoyak, pikel, sawi asin, bekasam, dan lain-lain (Rahayu, 2003) untuk mencari isolat-isolat yang mempunyai sifat fungsional yang dapat meningkatkan kesehatan. Isolat yang diperoleh dapat dipergunakan sebagai kultur starter pada pangan fermentasi sehingga akan menaikkan nilai tambah produk fermentasi menjadi bernilai fungsional.

Karakterisasi dan fungsionalitas isolat-isolat bakteri asam laktat asal mandai masih belum dilakukan dan perlu diinvestigasi lebih lanjut untuk mengetahui kelayakan sebagai kandidat probiotik. Tujuan dari penelitian ini adalah melakukan isolasi dan mengkarakterisasi isolat bakteri asam laktat asal mandai sebagai bagian dari seleksi sesuai kriteria sebagai kandidat probiotik.

2. METODE PENELITIAN

Kultur Bakteri

Kultur bakteri, Escherichia coli ATCC 25922, Listeria monocytogenes ATCC 13932, Bacillus cereus ATCC 10876, dan Salmonella typhimurium ATCC 14028 diperoleh dari SEAFAST Center IPB. Enterococcus faecalis ATCC 19433 dibeli dari Oxoid. Semua bakteri patogen kecuali Enterococcus faecalis ATCC 19433 dipelihara dalam BHI broth (Oxoid, Hampshire UK). Semua isolat bakteri asam laktat dan Enterococcus faecalis ATCC 19433 dipelihara dalam MRS broth (Oxoid, Hampshire UK).

Pengumpulan Sampel

Tiga kelompok sampel mandai (9 sampel masing-masing, untuk kadar garam 5, 10 dan 15%), dikumpulkan dari 5 industri rumah tangga di Samarinda, Kalimantan Timur. Dami cempedak segar dalam larutan garam 5, 10 dan 15% dibuat oleh masing-masing industri rumah tangga setelah dipesan secara khusus. Proses pembuatan mandai dilakukan dengan cara sebagai berikut: dami cempedak yang telah dibersihkan dari kulit luarnya, dibubuhi garam dapur dengan konsentrasi 5, 10 dan 15% (b/v) kemudian dimasukkan ke dalam stoples yang bersih. Air ditambahkan sampai seluruh permukaan dami terendam oleh air. Wadah ditutup dan diberi beberapa lubang untuk aerasi.

Mandai yang baru dibuat dibawa ke laboratorium dan dibiarkan pada suhu ruang selama 12 hari. Kondisi fermentasi aerobik dan pada suhu ruang dilakukan sesuai kondisi fermentasi mandai yang sesungguhnya di produsen mandai. Penghitungan dan isolasi bakteri serta penentuan pH dilakukan pada hari fermentasi ke 4, 8 dan 12.

Penghitungan dan Isolasi Bakteri Asam Laktat Selama Fermentasi Mandai Sepuluh gram sampel, secara aseptis, dimasukkan ke dalam 90 ml larutan fisiologis (mengandung 0.85% NaCl) dan dihomogenkan. Suatu seri pengenceran (10-1-10-6) dibuat untuk masing-masing sampel. Satu ml dari pengenceran yang sesuai dipupuk pada cawan dan dituang MRS agar (Oxoid, Hampshire UK) yang disuplementasi dengan 0.3% garam empedu (Difco) dan 3% CaCO3 (Merck,

Darmstadt, Germany). Semua cawan diinkubasi pada 30oC selama 24-48 jam secara aerobik. Penghitungan dilakukan pada cawan yang berisi 25-250 koloni sesuai BAM (2001).

Koloni yang representatif dicuplik dari cawan dan digores pada cawan berisi MRS agar. Koloni yang mempunyai morfologi berbeda dimurnikan dengan cara dicuplik dan digoreskan kembali pada cawan baru berisi MRS agar sampai dihasilkan koloni dengan bentuk dan ukuran seragam. Satu koloni tunggal dicuplik dan digoreskan pada agar miring. Morfologi isolat diamati dengan melakukan pewarnaan Gram dan uji katalase menggunakan hidrogen peroksida 3%. Isolat dengan morfologi batang/bulat Gram positif dan katalase negatif dikonfirmasi sebagai bakteri asam laktat.

Stok kultur gliserol dibuat untuk tujuan pengawetan kultur. Masing-masing isolat diinokulasi dalam MRS broth (Oxoid, Hampshire UK) yang mengandung 30% gliserol dan disimpan pada -20oC. Stok kultur diperbaharui setelah penyimpanan 6 bulan. Untuk penyimpanan jangka panjang, dilakukan liofilisasi terhadap kultur terpilih.

Kemampuan bertahan dalam pH 2.0 (Hosseini et al. 2009)

Kemampuan isolat bakteri asam laktat untuk bertahan dalam suasana asam di lambung dievaluasi dengan menginkubasi bakteri dalam suasana pH 2.0 sesuai pH lambung selama 3 jam. Sel bakteri asam laktat dari kultur 24 jam dalam MRS broth dipanen dengan sentrifugasi, dicuci dengan PBS steril (Oxoid, Hampshire UK). Sel bakteri diresuspensi dalam PBS steril yang telah disesuaikan pH-nya menjadi pH 2.0 dan diinkubasi pada 37oC selama 3 jam. Jumlah bakteri asam laktat sebelum dan setelah inkubasi ditentukan pada MRS agar.

Toleransi terhadap garam empedu

Kemampuan isolat untuk tumbuh pada media mengandung garam empedu ditentukan berdasarkan metode Vinderola dan Reinheimer (2003). Setiap isolat diinokulasi ke dalam MRS broth dan diinkubasi selama 24 jam pada 37oC. Isolat selanjutnya diinokulasi (2% v/v) dalam MRS broth mengandung 0.5% (w/v) garam empedu (Difco). Kultur diinkubasi pada 37oC selama 24 jam. Absorbansi ditentukan

Dalam dokumen Kajian Antiinfeksi Isolat Bakteri Asam Laktat Asal Mandai (Halaman 91-162)