BAB II TINJAUAN KEPUSTAKAAN
2.2. Penanda Tumor pada Kanker Payudara
2.3.5. b RT-PCR
Cerveira et al. pada tahun 2004 mengevaluasi sensitivitas teknik RT-PCR standar (sintesis cDNA oleh primer acak diikuti amplifikasi dengan nested-PCR tunggal)
dengan pendekatan yang lebih lugas: satu langkah RT-PCR(Sintesis cDNA dengan primer spesifik MGB –I dan PCR tunggal dalam reaksi yang sama, diikuti oleh nested- PCR dengan primer MG3 dan MG4 dalam tabung reaksi dingin yang sama sepanjang waktu untuk mencegah amplifikasi non-spesifik). Semua kasus yang dipelajari dalam rangkap dua, dengan analisa simultan dari kontrol negatif (donor darah), kontrol positif (jaringan payudara) dan kontrol air. Primer untuk nested-PCR dan PCR tunggal berasal dari sekwens dengan nomor akses Genbank U3314710 dan dirancang membatasi rentang ekson-ekson untuk mencegah amplifikasi DNA genomik.
Untuk memeriksa integritas setiap sampel mRNA dan cDNA, dilakukan amplifikasi gen kontrol beta-2-mikroglobulin (B2M; Genbank nomor akses NM004048) satu putaran tunggal PCR dengan kondisi yang identik untuk primer spesifik MGB-I (Cerveira et al., 2004).
Kemampuan deteksi metastase tersembunyi oleh RT-PCR sangat sensitif, yakni mampu mendeteksi sedikitnya satu salinan RNA untuk dikopi menjadi gen yang diekspresikan sampai 1.000 kopi / sel. Penggunaan kuantitatif real-time-PCR berdasarkan ambang batas pada sampel klinis, mengakibatkan ekspresi signifikan tingkat klinis RNA sehingga hasil positif palsu menjadi minimal (Backus et al., 2005).
Kuantitasi h-MAM mRNA berhasil dicapai dengan realtime RT-PCR kuantitatif, berdasarkan aktivitas 5'-nuklease polimerase TAQ-DNA. Teknik ini memungkinkan
kuantitasi otomatis dari amplifikasi produk.. Nilai m-RNA yang diukur, dibandingkan dengan nilai dari h-MAM yang mengekspresikan kurva standar cDNA yang diperoleh dari cell-line EFM-192 yang spefifik terhadap adenokarsinoma payudara (Zehentner et al., 2004 and Backus et al., 2005 ).
TaqMan probe dirancang untuk annealing regio internal dari produk PCR, dan mereka mengandung pewarna reporter berpendar yang letaknya berdekatan dengan pewarna quencher. Ketika probe TaqMan berpendar pada panjang gelombang yang tepat, pewarna reporter teraktivasi, sehingga, fluoresensi ini ditangkap oleh quencher sepanjang probe utuh. Quenching ini disebabkan energi resonansi transfer fluoresensi (FRET), di mana energi fluoresensi dari fluorophore ditransfer ke quencher. Namun, ketika polimerase TAQ-DNA dengan aktivitas 5'exonuklease yang menyentuh probe, pewarna reporter dilepaskan dari quencher dan dapat mulai berpendar. Deteksi akumulasi produk PCR dipantau oleh peningkatan fluoresensi. Yang penting, pembelahan probe hanya terjadi jika probe dihibridisasi pada target, yang memungkinkan amplifikasi hanya terjadi bila adayang
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
3.1. Jenis Penelitian
Penelitian ini adalah suatu penelitian deskriptif analitik dengan menggunakan desain cross sectional.
3.2. Tempat Penelitian
Pengisian kuesioner oleh subjek penelitian, pengambilan data hasil pemeriksaan imaging (foto rontgen, USG dan hasil lainnya),pengambilan darah tepi, tanda tangan informed consent dilakukan di Rumah Sakit Pirngadi dan praktek dokter swasta.
Pemeriksaan ekspresi mRNA Mammaglobin dengan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) dilakukan di Laboratorium Terpadu FK USU.
3.3. Waktu Penelitian
3.4 Populasi Penelitian
Populasi penelitian adalah wanita yang terdiagnosa kanker payudara dengan metastase dan non metastase yang berkunjung ke praktek dokter yang menangani terapi kanker dan RS Pirngadi. Subjek mendapatkan informasi tentang penelitian ini serta bersedia menjadi subjek penelitian.
3.5. Sampel Penelitian
Penentuan sampel dengan menggunakan tehnik consecutive sampling. Subjek
harus memenuhi persyaratan kriteria inklusi dan eksklusi yang diperoleh dengan metode wawancara, hasil pemeriksaan klinis dan imaging, hasil histopatogi serta
pengisian kuesioner (Lembar wawancara) Kriteria inklusi:
Wanita penderita baru kanker payudara dengan metastase yang belum menjalani kemoterapi berdasarkan riwayat klinis, histopatologi dan hasil imaging seperti foto X-Ray, USG, CT Scan.
Wanita penderita non metastase yang belum maupun sudah menjalani kemoterapi
Menandatangani informed consent. Kriteria eksklusi:
Besar sampel:
Besar sampel ditentukan dengan menggunakan rumus
n
:
n
=
27,31822 digenapkan menjadi 28 sampel Keterangan :Zα = nilai distribusi normal baku (table Z) pada α tertentu = 1,96 P = proporsi kategori variable yang diteliti = 80% (0,8)
Q = 1 – P = 1-0,8 = 0,2 d = presisi 15% (0,15)
3.6. Variabel Penelitian
3.5.1. Variabel bebas, yaitu ekspresi dan non ekspresi mRNA mammaglobin. 3.5.2. Variabel tergantung, yaitu kanker payudara metastase dan non metastase.
3.7. Kerangka Konsep 1.
Keterangan : Bagian yang diteliti
Variabel bebas : Ekspresi mRNA mammaglobin
Variabel terikat : Stadium kanker payudara
Wanita penderita Kanker Payudara Ekspr mRN mammag posi Ekspr mRN mammag nega Laboratorium/ Tumor Marker Pemeriksaan fisik Histopatologi
Perdarahan Infeksi Metastase Kematian
Diagnosa
Komplikasi Kelainan Genetika Faktor Lingkungan Hormon, Menarche Usia, Menopause Stadium IV (Metastase) Stadium I-III (Non metastase)DEFINISI OPERASIONAL N
o
Variabel Definisi Alat Ukur Cara Ukur Hasil Ukur Skala
Ukur 1 Stadium Non Metastase Stadium I-III yang ditetapka n sesuai dengan data pada rekam medis Pemeriksaan fisik dan penunjang (CT Scan, Mammografi, X- Ray, USG, MRI, Mikroskop) Membaca hasil pada rekam medis Stadium I- III Nominal 2 Stadium IV (Metastase) Stadium IV yang ditetapka n sesuai data pada rekam medis Pemeriksaan fisik dan penunjang (CT Scan, Mammografi, X- Ray, USG, MRI)
Membaca hasil pada rekam medis Stadium IV Nominal 3 Gen Mammaglobi n mRNA spesifik hanya terdapat pada jaringan payudara
Alat untuk isolasi mRNA & PCR cDNA Ekspresi m- RNA Mammaglobin pada Elektroforesis Band yang terbaca pada 402 bp Nominal
3.9. Rancangan Penelitian
Penelitian ini adalah suatu penelitian deskriptif analitik dengan pendekatan cross sectional study. Semua kegiatan penelitian termasuk lembaran informed consent
(Persetujuan Setelah Penjelasan) terlebih dahulu telah melalui persetujuan Majelis Komite Etik Penelitian (Ethical Clearance).
Populasi sampel diambil secara consecutive sampling dengan target populasi
wanita penderita kanker payudara dengan usia mulai dari 30 tahun sampai 70 tahun di kota Medan yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi. Setiap subjek telah dijelaskan tentang penelitian yang akan dilakukan, serta tujuan, prosedur, manfaat dan risiko sebagai subjek dalam penelitian (perasaan tidak nyaman sewaktu pengambilan darah) (Lampiran 1). Semua subjek yang setuju ikut serta dalam penelitian, kemudian menandatangani informed consent, yaitu persetujuan secara
tertulis sebagai subjek dalam penelitian (Lampiran 2). Lalu dilakukan pengumpulan data dengan cara pengisian kuesioner (Lampiran 3), Juga dilakukan pengumpulan hasil pemeriksaan Histopatologi, Imaging seperti foto Rontgen, USG, CT-Scan, MRI ataupun PET CT bila ada (Lampiran 4).
Darah vena sebanyak 3 ml diambil dengan spuit dari area fossa cubiti. Sampel
darah dimasukkan kedalam tabung yang berisi EDTA sebagai anti pembekuan, lalu disimpan dan dilengkapi dengan label identitas masing-masing peserta pada suhu - 20˚C hingga hari uji dilakukan.
Dari data yang diperoleh, dipilih yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi, Pada hari uji, sampel yang memenuhi kriteria seperti yang telah ditentukan, diperiksa ekspresi mRNA Mammaglobin dengan menggunakan mesin PCR.
Semua data dikumpulkan, dikelompokkan dan dilakukan analisa statistik menggunakan menggunakan software SPSS dengan uji Chi Square dan bila tidak
terpenuhi, akan dilakukan uji Fisher sebagai alternatif. Kemaknaan yang dinilai adalah bila p<0,05. Dinilai apakah ekspresi mRNA Mammaglobin mampu membedakan kelompok metastase dan non-metastase.
3.10. Pelaksanaan Penelitian
Dari data histopatologi dan hasil imaging (X foto rontgen, USG maupun CT Scan, MRI dan lainnya), yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi diperoleh sebanyak 29 subjek , dibagi menjadi dua kelompok : yaitu yang metastase sebanyak 13 orang dan yang non metastase sebanyak 16 orang.
3.10.1. Prosedur pemeriksaan Ekspresi mRNA Mammaglobin :
3.10.1.1. Isolasi RNA
Menggunakan reagent Instagene Matrix dari BioRad, dengan protokol sebagai
berikut :
Alat Bahan
Sentrifugasi Nuclease free water
Vortex Microtube 1,5 mL
Mikropipet ukuran berbagai ukuran Tips berbagai ukuran Cara Kerja :
Step Pertama
Disiapkan tabung Microtube 1,5 mL
Dimasukkan 100 uL darah kemudian tambahkan 350 uL Lysis Solution dari Norgen Lalu diVortex selama 15 detik untuk melarutkan darah
Selanjutnya ditambahkan 200 uL Etanol 96% ke dalam Lisat Lisat yang telah tercampur lalu diVortex kembali selama 10 detik.
Step kedua
Dari tabung Microtube diatas, diambil 600 uL Lisat dan dimasukkan ke dalam tabung Columm
Kemudian disentrifugasi selama 1 menit agar semua cairan Lisat melewati saringan pada tabung Columm
Dilakukan pemeriksaan ulangan untuk melihat bila masih ada cairan Lisat tersisa, sentrifugasi kembali sampai cairan lewat semua, kemudian buang cairan yang tertampung dari tabung kolektor.
Step ke tiga
Dimasukkan 400 uL Wash Solution ke dalam tabung Columm di step 2 Lalu sentrifugasi selama 1 menit dan cairan dalam tabung kolektor dibuang. Ditambahkan 400 uL Wash Solution sekali lagi dan sentrifugasi selama 1 menit Lalu semua cairan yang tersisa dalam tabung kolektor dibuang dan disentrifugasi selama 2 menit lagi sampai tabung Columm benar benar kering.
Step ke empat
Tabung Columm selanjutnya ditempatkan pada tabung Elution
Kemudian ditambahkan 50 uL Elution Solution ke tabung Columm tadi.
Lalu sentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 2000 Rpm, dengan kecepatan 13.000 Rpm selama 1 menit.
Sentrifugasi dilakukan berulang sampai Elution Solution lewat semua yang tampak
sebagai cairan di dasar tabung sebagai RNA.
RNA siap di pakai, boleh disimpan pada suhu – 20 C
3.10.1.2. Pembuatan cDNA total dengan RT-PCR
Menggunakan reagent iScript cDNA synthase dari BioRad. Adapun protokol
pengerjaan sebagai berikut :
a. Semua komponen untuk reaksi cDNA dimasukkan pada tabung mikro steril/ tube PCR seperti tabel 1
Tabel 1. Komposisi sintesis cDNA
Komponen Percontoh (sampel)
RNA total (20 ng) 10 uL
iScript reaction mix 4 uL
iScript reverse transcriptaseenzyme 1 uL
Nuclease-free water 5 uL
Volume total 20 uL
b. Kemudian tube PCR tersebut dimasukkan ke dalam mesin PCR dan mengikuti profil PCR sebagai berikut : 250C selama 5 menit, dilanjutkan pada suhu 420C
selama 30 menit dan 850C selama 5 menit.
Catatan : jika sudah dilakukan isolasi RNA, maka harus dilanjutkan hingga cDNA
synthesis.
3.10.1.3. Isolasi Gen spesifik dari cDNA total:
Menggunakan reagents IQ Supermix dari BioRad. Adapun protokol pengerjaan
sebagai berikut ini :
Tabel 2, Alat dan Bahan yang perlu disiapkan :
Alat Bahan
PCR Nuclease free water
Mikropipet ukuran 1-10 uL PCR tube
Mikropipet ukuran 10 -100 uL Tips berbagai ukuran Mikropipet ukuran 100-1000 uL primer
Cara Kerja :
a. Semua komponen pada tabel 3 untuk reaksi cDNA spesifik dicampur dalam tabung mikro steril/ tube PCR
b. Primer yang dipergunakan adalah :
Primer forward 5’-CAG CGG CTT CCT TGA TCC TTG-3’
Primer Reverse 5’-ATA AGA AAG AGA AGG TGT GG-3’(Grunewald., 2000) Tabel 3. Komposisi Reaksi PCR spesifik
Komponen reaksi Konsentrasi Awal Konsentrasi Akhir Volume
Nuclease free water 14,8
PCR Buffer 10x 1 x 2 dNTP mix 10 µM 0,5 µM 0,4 MgCl2 2 x 1 x 0,6 Primer F (10uM) Primer R (10 uM) cDNA/Plasmid template iTag DNA Polymerase
10 uM 10 uM 5 U/uL 0,25 uM 0,25 uM 1 Unit 0,5 0,5 1 0,2 Volume total 20 µL
Tube PCR tersebut selanjutnya dimasukkan ke dalam mesin PCR Adapun Profil PCR yang sebelumnya sudah dilakukan optimasi adalah: 1. 95,0 C selama 3 menit
2. 95,0 C selama 10 detik
3. Gradient 57,0 C selama 30 detik 4. 72,0 C selama 30 detik
5. Kembali ke step 2 sebanyak 35 X 6. 72,0 C selama 7 menit
3.10.1.4. Elektroforesis
Sampel DNA hasil amplifikasi diambil sebanyak 5 μl dan dicampurkan masing- masing dengan 2 μl loading buffer. Campuran ini selanjutnya dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel agarose. Untuk mengamati kehadiran larik (band) DNA, dilakukan pewarnaan menggunakan GelRed dari Biotium.
Pada elektroforesis ini, digunakan Certified PCR Low Melt Agarose dari BioRad. Hal ini dikarenakan agarose ini memiliki kemampuan pemisahan yang tinggi dan menghasilkan resolusi yang sangat baik dari fragmen dengan ukuran rendah < 1000 bp.
Hasil elektroforesis dibandingkan dengan ukuran ladder sehingga diperoleh
ukuran kasar dari gen yang sudah diperoleh. Adanya kehadiran larik (band) dari cDNA spesifik dan memiliki ukuran yang sesuai dengan gen yang diinginkan menunjukan adanya kehadiran gen tersebut.