BAHAN DAN METODE
3.2. Bahan dan Alat
Mikrob yang digunakan diisolasi dari limbah cair industri pengolahan kelapa sawit PT. Bumi Pratama Khatulistiwa, Pontianak, dan beberapa lokasi tanah gambut yang mempunyai pH rendah di perkebunan Nanas dan Kelapa PT. Pulau Sambu, Riau, wilayah Terminal Agrobisnis dan kawasan Aloevera Center, di Siantan Kalimantan Barat serta tanah mineral dengan pH rendah di perkebunan lidah buaya Tabanan, Denpasar.
Bahan kimia yang digunakan adalah ekstrak khamir (Scharlau), (NH4)2SO4 (Merck), MgSO4.7H2O (Univar), KH2PO4 (Univar), NaOH (Merck), H2SO4
Peralatan yang digunakan adalah laminar, sentrifuse, mikroskop, autoklaf, pH meter, biuret, spektrofotometer, High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Varian 940 LC, desikator, oven, shaker, cawan petri, tabung reaksi, pipet, gelas ukur, bunsen, erlenmeyer, timbangan, magnetic stirer, vortex, stirer, kertas saring.
(Merck), metanol, asam p-kumarat (Sigma), asam sinamat (Sigma Aldrich), asam ferulat (Sigma Aldrich), asam vanilat (Sigma Aldrich), asam siringat (Sigma), asam p-hidroksibenzoat (Sigma), indikator phenol phtalin, alkohol. Bahan mikrobiologi yang digunakan adalah Nutrien Agar (NA), Potatoes Dextrose Agar (PDA), de Mann Rogosa Sharpe (MRS).
3.3. Metode
3.3.1. Tahapan Penelitian
1. Ekstraksi asam-asam organik dari tanah gambut beberapa wilayah. 2. Isolasi mikrob dari beberapa sumber dan pemurniannya.
3. Seleksi mikrob pendegradasi asam-asam organik.
4. Karakterisasi pertumbuhan mikrob pendegradasi asam organik.
3.3.2. Ekstraksi Asam-asam Organik dari Tanah Gambut
Ekstraksi asam-asam organik dari tanah gambut menggunakan cara yang dilakukan oleh Maciak dan Harms (1986) dengan modifikasi. Terhadap sepuluh gram tanah ditambahkan 100 ml NaOH 2 M dan dikocok dengan shaker selama 3 jam. Larutan dipisahkan dari sisa fraksi padat dengan sentrifugasi selama 20 menit 8000 rpm (8770 xg). Larutan H2SO4 ditambahkan secara bertahap dalam fraksi larutan sambil di aduk, sampai terjadi pengendapan sempurna. Fraksi larutan dipisahkan dengan sentrifugasi 8770 xg selama 20 menit dan digunakan sebagai sumber karbon dalam penelitian.
3.3.3. Analisa Total Asam, Metode Titrasi (AOAC, 1990)
Sampel sebanyak 2 ml dipipet, dimasukkan kedalam erlenmeyer 250 ml. Cairan selanjutnya diencerkan dengan akuades sampai volume 20 ml (FP : 10 kali) dan diberi beberapa tetes indikator phenol phtalin. Cairan dititrasi dengan larutan NaOH 0,1 N hingga terbentuk warna merah muda.
Seleksi mikrob pendegradasi asam-asam organik tanah gambut
Karakterisasi pertumbuhan mikrob Isolasi mikrob dari tanah & limbah cair
industri pengolahan kelapa sawit
Ekstraksi asam-asam organik dari
tanah gambut
Pre kultur 1 Pre kultur 2
Rumus perhitungan total asam :
3.3.4. Analisa Asam Fenolat
Kadar turunan asam fenolat dideteksi dengan HPLC, sebanyak 10 ml sampel atau medium diasamkan hingga pH 2,5 dengan 1 M HCl, kemudian diencerkan dengan menambahkan 10 ml campuran larutan metanol (MeOH) : air (H2O) : asam asetat (HOAc), selanjutnya diambil 2,5 ml untuk dilakukan penetapan asam fenolat dengan HPLC. Penetapan jenis asam-asam fenolat berdasarkan sistem mekanisme pemisahan partisi menggunakan kolom fase terbalik yakni kolom C18 merek BondapakTM ukuran 3.9 x 300 mm dan detektor UV dengan lampu D2 pada panjang gelombang 240 nm.
3.3.5. Isolasi mikrob
Setengah mililiter limbah cair industri pengolahan kelapa sawit diinokulasikan kedalam medium Nutrien Agar (NA), Potatoes Dextrose Agar (PDA), de Mann Rogosa Sharpe (MRS) dan diinkubasi pada suhu kamar selama 1-3 hari. Pemurnian isolat dilakukan dengan menumbuhkan koloni kedalam medium agar miring.
Isolasi mikrob dari limbah cair industri pengolahan kelapa sawit :
Satu gram contoh tanah gambut atau tanah mineral dilarutkan dalam 9 ml air steril kemudian divortex. Sebanyak 0,5 ml larutan diinokulasi dalam medium Nutrien Agar (NA), Potatoes Dextrose Agar (PDA), de Mann Rogosa Sharpe (MRS) dan diinkubasi pada suhu kamar selama 1-3 hari. Pemurnian isolat dilakukan dengan menumbuhkan koloni kedalam medium agar miring.
Isolasi mikrob dari tanah
Total asam = V NaOH x N NaOH x (Faktor Pengenceran) V sampel
3.3.6. Seleksi Mikrob Pendegradasi Asam Organik
Sebanyak 1 ose masing-masing isolat diinokulasikan kedalam 10 ml medium cair Czapek’s dengan modifikasi (Labeda, 1990), dengan komposisi (g/liter) : MgSO
Pre kultur 1 :
4.7H2O 0,5 g; (NH4)2SO4 3 g; KH2PO4 1 g; ekstrak khamir 0,5 g dan asam organik 33,1 mN-NaOH, pH medium 3,8. Sebelum inokulasi medium disterilisasi selama 20 menit (1 atm, 121 oC). Inkubasi dilakukan pada suhu kamar dengan pengocokan 120 rpm selama 24 jam (untuk bakteri dan khamir) dan 48 jam (untuk fungi).
Kultur hasil pre kultur 1 sebanyak 10 ml diinokulasikan kedalam 100 ml medium Czapek’s dengan modofikasi (Labeda, 1990), dengan komposisi (g/liter) : MgSO
Pre kultur 2 :
4.7H2O 0,5 g; (NH4)2SO4 3 g; KH2PO4 1 g; ekstrak khamir 0,5 g dan asam organik 33,1 mN-NaOH, pH medium 3,8. Sebelum inokulasi medium disterilisasi selama 20 menit (1 atm, 121 oC). Inkubasi dilakukan pada suhu kamar dengan pengocokan 120 rpm selama 24 jam (untuk bakteri dan khamir) dan 48 jam (untuk fungi).
Kultur hasil pre kultur 2 sebanyak 10 ml diinokulasikan pada 100 ml medium Czapek’s dengan modifikasi (Labeda, 1990), dengan komposisi (g/liter) : MgSO
Tahap Seleksi :
4.7H2O 0,5 g; (NH4)2SO4 3 g; KH2PO4 1 g; ekstrak khamir 0,5 g dan asam organik 33,1 mN-NaOH, pH medium 3,8. Medium disterilkan selama 20 menit (1 atm, 121 oC). Kultur diinkubasi pada suhu kamar dengan pengocokan 120 rpm selama 48 jam (untuk bakteri dan khamir) dan 96 jam (untuk fungi). Masing-masing dilakukan dengan ulangan 2 kali. Parameter yang diamati selama fermentasi adalah pH medium, OD620
Seleksi mikrob yang paling optimal dalam mendegradasi asam organik dilakukan berdasarkan kemampuan mikrob dalam mengkonsumsi asam organik sebagai sumber karbon tunggal yaitu melalui parameter penurunan kandungan total asam dan kenaikan nilai pH. Mikrob dengan kenaikan pH paling tinggi diikuti dengan penurunan total asam yang signifikan adalah mikrob terseleksi
yang akan digunakan untuk percobaan selanjutnya (optimalisasi medium pertumbuhan).
3.3.7. Karakterisasi Pertumbuhan
Karakterisasi pertumbuhan dilakukan melalui optimalisasi sumber karbon dan nitrogen. Konsentrasi asam organik sebagai sumber karbon (C1, C2, C3, C4) masing-masing adalah 33,1; 66,2; 99,3; 132,4 mN-NaOH/liter medium, sedangkan konsentrasi (NH4)2SO4 sebagai sumber nitrogen (N1, N2, N3, N4) masing-masing adalah 1, 2, 3, 4 gr/liter medium. 10 ml kultur isolat unggul diinokulasikan pada 100 ml medium (komposisi seperti pada Tabel 1.) dan diinkubasikan pada suhu kamar dengan pengocokan 120 rpm selama 48 jam sampai 96 jam tergantung jenis isolat yang diperoleh. Pengamatan yang dilakukan adalah total asam, pH, pertumbuhan sel (OD620 atau bobot kering sel). Percobaan dilakukan dengan jumlah ulangan 2.
Tabel 2 Variasi sumber karbon dan sumber nitrogen dalam medium pertumbuhan *)
Sumber Karbon = asam organik (mN-NaOH/liter
medium)
Sumber Nitrogen = (NH4)2SO4 (g/liter medium)
N1=1 N2=2 N3=3 N4=4 C1= 33,1 C1N1 C1N2 C1N3 C1N4 C2=66,2 C2N1 C2N2 C2N3 C2N4 C3= 99,3 C3N1 C3N2 C3N3 C3N4 C4= 132,4 C4N1 C4N2 C4N3 C4N4 *) Komposisi medium lainnya adalah MgSO4.7H2O; KH2PO4 dan ekstrak khamir.
3.3.8. Rancangan Penelitian
Data hasil penelitian dianalisis menggunakan percobaan faktorial dengan rancangan dasar Rancangan Acak Lengkap (2 faktor).
Model yang digunakan :
Y = µ + Ni + Cj + NiCj + ε
dimana :
Y = Respon percobaan µ = Rataan perlakuan Ni C = Faktor N ke-i, i = 1, 2, 3, 4 j N = Faktor C ke-j, j = 1, 2, 3, 4 iCj ε
= Pengaruh interaksi N ke i dan C ke j