Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan di laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA), Institut Pertanian Bogor (IPB) mulai bulan Juni 2008 sampai Mei 2009.
Bahan dan Alat :
Bahan yang digunakan ialah isolat Streptomyces LSW05, LBR02, SSW02, dan PS4-16 koleksi Dr. Ir. Yulin lestari dengan bakteri target: Ralstonia
solanacearum, Xanthomonas axonopodis, X. oryzae, Bacillus subtilis dan B. cereus, sedangkan cendawan target: Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani,
dan Sclerotium rolfsii, koleksi Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi FMIPA IPB. Alat yang digunakan antara lain spektrofotometer, kertas cakram (Φ: 8 mm), sentrifuge, water bath, penggoyang, sedotan plastik (Φ: 8 mm).
Metode Penelitian :
Peremajaan Isolat Streptomyces spp. dan Mikroba Patogen Tular Tanah
Streptomyces LBR02, SSW02, dan LSW05 diremajakan ke dalam media
YMA (Yeast Malt Agar) sedangkan PS4-16 diremajakan pada media OA (Oatmeal Agar) dan diinkubasi selama 10 hari pada suhu ruang (24 – 26 0C)..
Bakteri target diremajakan pada media NA (Nutrient Agar) (Lampiran 1), diinkubasi selama 24 jam. Cendawan target diremajakan pada media PDA (Potato
Dextrosa Agar) (Lampiran 1), diinkubasi selama 2 – 3 hari untuk Rhizoctonia solani dan S. rolfsi dan 5 – 7 hari untuk Fusarium sp. dan semua bakteri maupun
cendawan target diinkubasi dalam suhu ruang (24 – 260C).
Pembuatan Inokulum Mikroba Patogen Tular Tanah
Bakteri patogen tular tanah yang telah diremajakan pada media NA di tumbuhkan pada media NB (Nutrient Broth) (Lampiran 1) selama 14 sampai 18 jam. Absorbansi dukur pada panjang gelombang 620 nm, sampai diperkirakan jumlah sel 106 Cfu/ml (OD Bacillus sp.: 0.223, Xanthomonas sp.: 0.102,
R. solanacearum: 0.352). Inokulum cendawan patogen tular yang telah
diremajakan pada media PDA kemudian diambil dengan menggunakan sedotan plastik steril yang berdiameter 8 mm, dan ditumbuhkan pada media PDA lkemudian digunakan dalam uji lanjut.
Uji Antagonis Langsung Kemampuan Penghambatan Streptomyces spp. terhadap Mikroba Patogen Tular Tanah
Uji antagonis langsung terhadap bakteri target dilakukan dengan metode difusi agar (Madigan & Martinko 2006), dengan mengambil sebanyak masing-masing 100 μl (106 cfu/ml) bakteri patogen yang telah ditumbuhkan pada media NA semi padat (0,85%), disebar merata pada seluruh permukaan media NA padat, dibiarkan mengering 5 – 10 menit. Isolat Streptomyces spp. berumur 10 hari diambil dengan sedotan plastik steril berdiamater 8 mm, diinokulasikan di atas permukaan media NA yang telah di tumbuhi bakteri patogen tersebut. Inkubasi dilakukan selama 24 jam pada suhu ruangan dan pengamatan dilakukan dengan melihat zona yang terbentuk dikurangi dengan diameter pertumbuhan isolat
Streptomyces spp.
Uji antagonis langsung terhadap cendawan patogen target dilakukan dengan menggoreskan Streptomyces spp. pada satu sisi media PDA dalam cawan petri berdiameter 9 cm dan diinkubasi selama 3 – 5 hari (sporanya terlihat), selajutnya dengan sedotan plastik steril cendawan diinokulasikan pada tengah cawan dalam media tersebut, dengan jarak 3 cm dari cendawan. Hambatan pertumbuhan terlihat dengan membandingkan pertumbuhan cendawan yang ditotolkan bersamaan dengan isolat uji dengan cendawan kontrol. Penghambatan terlihat dengan adanya zona bening yang nampak pada sekitar daerah kontak antara Streptomyces spp. dengan cendawan target. Zona bening diukur dengan mengurangkan diameter koloni cendawan yang dihambat dengan diameter koloni cendawan kontrol.
Optimasi Produksi Senyawa Anti mikroba
Optimasi produksi senyawa anti mikroba dari isolat Streptomyces spp. dilakukan terhadap dua macam media tumbuh: media ISP4 (Lampiran 2) dan media modifikasi molase-kedelai (Lampiran 2), pada 3 kondisi pH yaitu: pH 5, pH7, dan pH 9. Kondisi 4 suhu berbeda yaitu: (suhu ruang: 24 – 26 0C), 30 0C,
400C, dan 500C. Optimasi waktu produksi yang digunakan adalah 5 hari, 10 hari, dan 15 hari pertumbuhan.
Isolat diinokulasikan dalam media produksi uji, kemudian ditempatkan pada
rotari shaker selama 5 – 15 hari pada suhu ruang. Selanjutnya biakan
disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 10000 rpm pada suhu 40C untuk memisahkan antara pelet dan filtrat kultur. Filtrat kultur yang digunakan untuk uji lanjut.
Optimasi tahap pertama dilakukan terhadap media, dan waktu produksi.
Streptomyces spp. yang ditumbuhkan pada media peremajaan diambil dengan
menggunakan sedotan plastik steril berdiameter 8 mm dan diinokulasikan ke dalam media tumbuh ISP4 dan modifikasi molase dan kedelai. Pada hari ke 5, 10, dan 15 dilakukan panen filtrat yang digunakan dalam uji antagonis terhadap mikroba patogen tular tanah.
Optimasi tahap ke dua yaitu optimasi terhadap pH 5, pH 7, dan pH 9. Hasil dari optimasi media dan waktu poduksi pada tahap pertama digunakan sebagai dasar untuk optimasi selanjutnya. Isolat yang menghasilkan anti mikroba yang optimum pada media terpilih, waktu produksi dan pH optimum hasil dari tahap pertama selanjutnya diinkubasi pada suhu ruang, suhu 30 0C, suhu 40 0C, dan suhu 50 0C. Hasil panen filtrat dari optimasi ini, kemudian di uji antagonis terhadap bakteri dan cendawan patogen target.
Bioesei Filtrat Kultur Streptomyces spp. terhadap Pertumbuhan Bakteri Patogen Tular Tanah
Filtrat kultur isolat Streptomyces spp. terpilih digunakan untuk pengujian daya hambat terhadap bakteri patogen dengan metode difusi agar (Madigan & Martinko 2006). Cara pengujian dilakukan dengan mengambil 100 μl (106cfu/ml) masing-masing biakan bakteri patogen dimasukkan dalam NA semi padat (0.85%), kemudian disebar pada cawan petri yang telah berisi NA padat (1.5%), kemudian media berisi bakteri patogen target tersebut dicampur sampai rata, dan didiamkan 5-10 menit agar mengering. Selanjutnya cakram kertas berdiameter 8 mm diletakkan dengan sedikit ditekan, kemudian pada masing-masing cakram di tetesi 15 μl filtrat kultur Streptomyces spp. yang diujikan. Pengamatan dilakukan
setelah inkubasi 24 jam pada suhu ruang. Besarnya diameter zona bening yang terbentuk diamati berdasarkan diameter seluruh zona hambat dikurangi diameter cakram kertas.
Bioesei Filtrat Kultur Isolat Streptomyces spp. terhadap Pertumbuhan Cendawan Patogen Tular Tanah
Cendawan hasil peremajaan diambil dengan menggunakan sedotan plastik steril dan ditumbuhkan pada media PDA. Kertas cakram diletakkan pada jarak 3 cm dari cendawan tersebut, kemudian pada kertas cakram tersebut ditetesikan 15 μl filtrat kultur Streptomyces spp.Inkubasi dilakukan pada suhu ruang selama 3 – 5 hari. Hambatan pertumbuhan diukur dengan mengurangkan diameter pertumbuhan koloni cendawan yang dihambat filtrat Streptomyces spp. uji dengan pertumbuhan koloni cendawan kontrol.
Pengukuran Berat Kering Sel dan Kadar Gula dalam Media
Berat kering sel diukur berdasarkan berat pelet hasil panen. Pemanenan dilakukan pada hari ke-5, ke-10, dan ke-15 hari pertumbuhan. Pelet hasil panen disentrifugasi 10000 rpm selama 15 menit dengan suhu 4 0C, kemudian disaring dengan kertas saring Whatman dan dikeringkan pada suhu 70 0C selama 24 jam, kemudian ditimbang. Berat kering sel diukur setelah dikurangi dengan berat kertas. Pengukuran dilakukan dengan dua kali ulangan.
Pengukuran kadar gula dalam media produksi terpilih diukur berdasarkan metode DNS (Dinitrosalisilat-Miller 1959) (Lampiran 3). Pengukuran dilakukan dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 550 nm. Larutan glukosa digunakan sebagai standar, dan pengukuran dilakukan dengan dua kali ulangan. Kadar gula yang terpakai dihitung dengan menghitung kadar gula dalam media awal dikurangi dengan kadar gula terukur pada waktu pengamatan.