BAHAN DAN METODE

BAB III REGENERASI TEBU SECARA IN VITRO

BAHAN DAN METODE

Penelitian ini menggunakan pucuk tebu sebagai sumber eksplan dari 3 kultivar tebu yaitu: cv. Triton (V1), cv. PSJT 94-41 (V2), dan cv. PA 175 (V3). Adapun cara pembuatan media dan komposisi bahan kimia media yang digunakan dalam penelitian ini dapat dilihat pada Lampiran 1 dan 2.

Penelitian regenerasi tebu secara in vitro ini terdiri dari 3 tahap yaitu: inisiasi kalus, inisiasi tunas, dan inisiasi akar. Data yang diperoleh dianalisis dengan sidik ragam dan dilanjutkan dengan DMRT (Duncan’s Multiple Range Test) pada taraf 5 %, sejauh yang dapat dilakukan analisis statistika. Data lainnya dianalisis dengan melakukan banding sederhana serta perhitungan secara persentase.

A Inisiasi kalus

Tebu cv. Triton, cv. PA 175, dan cv. PSJT 94-41 diambil pucuknya yang masih menggulung. Pucuk tersebut dipotong 20 cm tepat di atas jaringan meristem. Sterilisasi dilakukan dengan pencelupan dalam alkohol 70 % dan dibakar di atas nyala api spiritus. Sterilisasi ini diulang sampai 3 kali dengan membuka dan membuang lapis pucuk daun hingga diperoleh daun muda yang masih menggulung. Eksplan dipotong dengan ukuran 2–3 mm, dan ditanam pada media MS dengan variasi pemberian ZPT sesuai dengan perlakuan. Setiap botol kultur berisi 5 potong eksplan yang kemudian diinkubasikan dalam ruang kultur dengan cahaya 2000 lux dan suhu 20^oC selama 4-6 minggu.

Rancangan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) secara faktorial dengan 2 faktor. Faktor pertama adalah kultivar tebu (V): cv. Triton (V1), cv. PSJT 94-41 (V2), dan cv. PA 175 (V3). Faktor ke-2 adalah modifikasi media padat MS dengan variasi penambahan 2.4-D (Z): 0.1 mg l^-1 kinetin + 1 mg l^-1 2.4 D (Z1); 0.1 mg l^-1 kinetin + 2 mg l^-1 2.4 D (Z2); 0.1 mg l^-1 kinetin + 3 mg l^-1 2.4 D (Z3); 0.1 mg l^-1 kinetin + 4 mg l^-1 2.4 D (Z4).

Perlakuan diulang 10 kali. Keseluruhannya berjumlah 120 satuan percobaan. Setiap satuan percobaan terdiri dari 4 botol eksplan yang langsung menjadi satuan pengamatan, jadi keseluruhannya adalah 480 botol kultur. Peubah

yang diamati pada minggu ke-6 adalah: persentase eksplan yang menghasilkan kalus per botol, struktur dan warna kalus, dan diameter kalus.

B Inisiasi tunas

Sumber eksplan berasal berasal dari kalus tipe A hasil sub kultur ke-1 hingga ke-2. Kalus diambil dengan ukuran yang seragam dan dikulturkan ke media yang sesuai dengan perlakuan. Setiap botol kultur berisi 4 kalus per botol dengan diameter ± 0.5 cm yang kemudian diinkubasikan dalam ruang kultur dengan cahaya 2000 lux dan suhu 20^oC selama 4 minggu.

Rancangan percobaan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) yang disusun secara faktorial dengan 2 faktor. Faktor pertama adalah kultivar tebu (V) yaitu cv. Triton (V1), cv. PSJT 94-41 (V2), dan cv. PA 175 (V3). Faktor ke-2 adalah variasi pemberian BAP pada media padat MS (U) yaitu: 0.1 mg l^-1 kinetin + 0.5 mg l^-1 BAP (U1); 0.1 mg l^-1 kinetin + 1.0 mg l^-1 BAP (U2); 0.1 mg l^-1 kinetin + 1.5 mg l^-1 BAP (U3); dan 0.1 mg l^-1 kinetin + 2.0 mg l^-1 BAP (U4).

Perlakuan diulang 10 kali. Keseluruhannya berjumlah 120 satuan percobaan. Setiap satuan percobaan terdiri 4 botol eksplan yang langsung menjadi satuan pengamatan, jadi keseluruhannya adalah 480 botol kultur. Peubah yang diamati adalah: persentase eksplan yang menghasilkan tunas, tinggi tunas dan jumlah tunas yang diukur pada minggu ke-6 minggu setelah kultur.

C Inisiasi akar

Eksplan yang digunakan berasal dari tunas in vitro yang sudah dipisahkan dari rumpunnya dengan ukuran yang seragam, dan berasal dari perlakuan 0.1 mg l^-1 kinetin + 1.0-1.5 mg l^-1 BA. Eksplan tersebut kemudian dikulturkan 1 tunas per botol. Rancangan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) yang disusun secara faktorial dengan 2 faktor. Faktor pertama adalah kultivar tebu (V) yaitu cv. Triton (V1), cv. PSJT 94-41 (V2), dan cv. PA 175 (V3). Faktor ke-2 adalah modifikasi komposisi media padat MS dengan variasi penambahan IBA (Q1) yaitu: dan 0.1 mg l^-1 kinetin + IBA 0.5 mg l^-1 (Q1); 0.1 mg l^-1 kinetin + IBA 1.0 mg l^-1 (Q2); 0.1 mg l^-1 kinetin + IBA 1.5 mg l^-1 (Q3); dan 0.1 mg l^-1 kinetin + IBA 2.0 mg l^-1 (Q4)

Perlakuan diulang 10 kali. Keseluruhannya berjumlah 120 satuan percobaan. Setiap satuan percobaan terdiri 4 botol eksplan yang langsung

menjadi satuan pengamatan, jadi keseluruhannya adalah 480 botol kultur. Tiap botol berisi satu eksplan yang diinduksikan perakarannya. Peubah yang diamati adalah: persentase eksplan yang membentuk akar, jumlah akar per tunas, panjang akar terpanjang per tunas yang diamati pada rusia 4 minggu. Ruang kultur diatur dengan cahaya 2000 lux dan suhu 20^oC.

Agrobacterium tumefaciens GV 2260

ABSTRAK

Tebu (Saccharum officinarum L.) merupakan komoditas utama yang banyak ditanam dilahan marginal di Indonesia. Phosphor (P) merupakan unsur yang menjadi faktor pembatas dalam pertumbuhan tanaman di lahan marginal. P disimpan tanaman dalam bentuk asam fitat (myo-inositolhexakisphosphate). Asam fitat dihidrolisis oleh fitase menjadi inositol dan P yang dapat digunakan tanaman. Guna mendapatkan tanaman yang memiliki kecukupan P selama proses pembelahan sel dan pertumbuhannya dapat dilakukan melalui transformasi genetik dengan gen fitase. Transformasi melalui Agrobacterium tumefaciens, merupakan metode yang paling sering digunakan untuk mengintroduksi gen asing ke dalam tanaman dan diregenerasikan sehingga menghasilkan tanaman transgenik. Seleksi dan regenerasi kalus hasil transformasi telah dilakukan dalam

media MS yang berisi kanamisin. Tujuan dari penelitian ini adalah: (1) mendapatkan media kanamisin yang terbaik sebagai marka seleksi; (2) menyisipkan gen fitase ke 3 kultivar tebu (cv.Triton, cv. PSJT 94-41, cv. PA

175) melalui Agrobacterium tumefaciens GV 2260 (pBinPI-IIEC); dan (3) menganalisa integrasi transgen dalam genom 3 kultivar tebu menggunakan

PCR.

Hasil penelitian menunjukkan (1) Konsentrasi kanamisin yang bersifat Lethal dosis pada tebu cv. Triton, cv. PSJT-94-41 dan cv. PA 175 secara berurut-turut adalah adalah 150 mg l^-1 ; 100 mg l^-1; dan 100 mg l^-1 kanamisin; (2) Efisiensi transformasi kalus tebu dengan gen fitase adalah 22 % (cv. Triton), 15 % (cv. PSJT 94-41); dan 24 % (cv. PA 175); (3) Tanaman transgenik (cv. Triton; cv. PSJT 94-41; dan cv. PA 175) hasil sub kultur ke-0 secara berturut-berurut adalah 24, 18, 30; sedangkan tanaman transgenik hasil sub kultur ke-1 secara berturut-berurut adalah 392, 360, dan 380 tanaman; (4) berdasarkan analisa PCR, ditemukan pita ukuran 900 bp pada tebu hasil transformasi (cv. Triton; cv. PSJT 94-41; dan cv. PA 175); (5) tanaman transgenik (cv. Triton; cv. PSJT 94-41; dan cv. PA 175) dengan aktivitas tinggi secara berturut-turut 46 %, 40 %, 45 %; aktivitas fitase sedang yaitu 31, 40, 27 %, dan aktivitas fitase rendah 23 %, 20 %, 27 % dari total sampel yang diamati. Sedangkan tanaman non transgenik (cv. Triton; cv. PSJT 94-41; dan cv. PA 175) secara berturut-turut dengan aktivitas fitase rendah sebanyak 90 %, 100 %, 100 % dari total sampel yang diamati; aktivitas fitase sedang: 10%, 0%, 0 %, dan tidak ada yang memiliki aktivitas fitase tinggi.

AGROBACTERIUM MEDIATED TRANSFORMATION OF PHYTASE