PENANDA SSR
4.2 Bahan dan Metode 1 Tempat dan Waktu
Kegiatan dilakukan mulai bulan Juni 2014 sampai dengan Juni 2015. Observasi sifat morfologi dilakukan di Rumah kaca, Balittro. Analisis molekuler dilakukan di laboratorium Molekuler Balittro dan BB Biogen.
4.2.2 Bahan dan Alat
Iradiasi sinar gamma menghasilkan 144 tanaman yang telah diiradiasi, tetapi terpilih 27 individu mutan putatif yang memiliki morfologi seperti tinggi tanaman, panjang daun, lebar daun, jumlah daun, jumlah ruas hampir sama dengan varietas asalnya. Bahan tanam yang digunakan untuk analisis karakter morfologi dan penanda SSR yaitu daun tanaman lada varietas Ciinten hasil iradiasi sinar gamma sebanyak 27 individu dan satu varietas Ciinten sebagai kontrol (Tabel 4.1). Bahan kimia untuk analisis molekuler yaitu mekraptoetanol, PVPP (polyvinyl polypyrrolidone), CTAB, akuades steril, CIAA (Chloroform isoamyl alcohol), alkohol absolut, isopropanol, etanol 70%, natrium asetat, agarose, air bebas ion, parafilm, buffer TAE, loading dye, primer SSR.
Peralatan yang digunakan untuk analisis karakter morfologi yaitu penggaris, pensil, jangka sorong, cawan petri, kamera. Peralatan untuk analisis SSR berupa mesin PCR (Polymerase Chain Reaction) Eppendorf, BIORAD elektroforesis, UV transluminator, Griffin Student waterbath, HIMAC sentrifuge CR15T, freezer Sanyo, neraca analitik Sartorius AC2115T (4 desimal), Oven Memmert, Vortex thermolyne maxi mix II type 37600 mixer, stirrer thermolyne naova II, pH meter Thermo Orion 420A+, pipet mikro eppendorf Axygen ukuran
0.5 l, 20 l, 100 l, 1000 l, pipet mohr 1 ml, 5ml, 10 ml, tabung eppendorf,
pipet tetes, Erlenmeyer, gelas piala, spatula, gunting, scapel, mortar dan microtube 1.5 ml dan 2 ml.
Tabel 4.1 Individu mutan putatif lada Ciinten yang digunakan untuk penanda morfologi dan SSR
No. Individu No. Individu No. Individu 1 R.I.25.3 11 B.I.25.16 21 B.II.25.2 2 R.I.25.4 12 B.I.50.1 22 B.II.25.6 3 R.I.25.5 13 B.I.50.2 23 B.II.25.26 4 R.I.25.13 14 B.I.50.7 24 B.III.25.6 5 R.II.25.3 15 B.I.50.10 25 B.III.25.9 6 R.II.25.5 16 B.I.50.13 26 B.III.25.17 7 R.II.25.11 17 B.I.50.16 27 B.III.25.28 8 R.III.25.8 18 B.I.50.17 28 Kontrol 9 R.III.25.12 19 B.I.50.18
10 B.I.25.14 20 B.II.25.1
Keterangan: B = Fase Benih dan R= Fase Benih dengan Radikula
4.2.3 Metodologi Penelitian 4.2.3.1 Penanda Morfologi
Metode dan pelaksanaan untuk analisis morfologi yaitu meliputi karakter pertumbuhan yang terdiri dari karakter kuantitatif dan kualitatif. Pengamatan pertumbuhan vegetatif dilakukan saat pertumbuhan optimal yaitu 8 BST. Karakter yang diamati yaitu tinggi tanaman, panjang daun, lebar daun, jumlah daun, jumlah ruas, jumlah cabangberdasarkan IPGRI.
4.2.3.2 Penanda Molekuler SSR
Analisa molekuler dilakukan saat pertumbuhan morfologi pada populasi M1 mencapai 3-4 daun. Sampel daun dari beberapa tanaman terseleksi diambil untuk dianalisis keragamannya dengan penanda SSR. Analisa ini akan dilakukan dengan menggunakan beberapa primer (Tabel 4.2).
Isolasi DNA menggunakan sampel daun tanaman diambil dan digerus dalam mortar menggunakan pestle dengan menambahkan buffer eksraksi CTAB sebanyak ±700µL (Doyle & Doyle 1990). Sampel digerus hingga merata dan dipindahkan ke dalam 1,5 mL microtube dengan menggunakan pipet. Microtube direndam dalam water bath bersuhu 650C selama 30 menit, lalu diinkubasi di suhu ruang selama 10 menit. Sebanyak 700 µL CIA ditambahkan ke dalam sampel dan dibolak-balik secara perlahan agar larutan tercampur. Sampel disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm pada suhu 40C selama 20 menit. Larutan DNA (berwarna bening di bagian atas) atau supernatan akan memisah dari larutan chloroform yang tercampur dengan bagian sel lainnya (berwarna hijau) pada fase bawah. Fase atas dipindah (±500-600 µL) dipindah ke microtube baru. Alkohol dingin (absolute 2x volume atau isopropanol 1x volume sampel) ditambahkan dan dibolak-balik secara perlahan, lalu sampel diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit. Sampel disentrifugasi dalam kecepatan 12.000 rpm pada suhu 40C selama 10-15 menit. Supernatan dibuang (DNA berupa endapan pada
dasar microtube). Endapan DNA dicuci dengan 70% ethanol, lalu dikeringanginkan di suhu ruang ± 15 – 20 menit. DNA dilarutkan menggunakan ddH2O sebanyak 50-100 µL dan disimpan pada suhu -200C.
Penentuan kuantitas DNA dengan Spektrofotometer: DNA diencerkan 100x dengan cara 15 µL DNA dimasukkan ke dalam mikrotube 1,5 mL dan ditambahkan aquades hingga 1,5 mL. Setting spektrofotometer ke 260 nm dan dibuat blanko. Sampel diencerkan ke dalam kuvet dan dihitung absorbansinya Konsentrasi atau kuantitas DNA dapat dihitung dengan persamaan :
Konsentrasi DNA (µg/mL) = 50 (µg/mL) x nilai absorbansi pada A260 x Faktor pengenceran
Proses PCR dilakukan dengan komposisi reaksi yaitu DNA Sampel 2 µl, PCR Mix 6 µl, primer SSR 0.5 µl, air bebas ion sebanyak 4 µl. PCR dijalankan dengan predenaturasi pada suhu 94ºC selama 4 menit, denaturasi pada susu 94ºC selama 4 menit, annealing pada suhu 37ºC selama 1 menit, amplifikasi 72ºC selama 1 menit, ekstensi 72ºC selama 5 menit dan proses PCR ini akan diulang sebanyak 35 siklus.
Tabel 4.2 Primer yang digunakan untuk analisa SSR pada tanaman lada
Lokus Nomor aksesi dalam bank gen Primer Sequence (5'-3') Psol3 JQ924478 F: CACGACGTTGTAAAACGACGCGGATCTTACCAGAATCAG R: GAGTAGCCTTTGGTTGTTGC Psol6 JQ924481 F: CACGACGTTGTAAAACGACCTCTTGGCAAAAGTCACCTG R: ATCCCATACCGATCTCCTTC Psol9 JQ924484 F: CACGACGTTGTAAAACGACGGAACCCACGAGTTTCTTG R: GGGGTCCTTTTTACGTTGAG Psol10 JQ924485 F: CACGACGTTGTAAAACGACCAGACGGATTCCCACTGAT R: GGACTTGTAACCCATCGAGA Psol11 JQ924486 F: CACGACGTTGTAAAACGACTTATTTGGTTGGAGCTGTGTG R: CCACGGTGGGTTATCACAC Psol15 JQ924490 F: CACGACGTTGTAAAACGACCGCGGACTAACCAGAGTTAC R: GCCACAAAAACCCACTCA Psol16 JQ924491 F: CACGACGTTGTAAAACGACGAAGTCCTAACCAGACCTGTG R: GAGGTGTTGTTGATGTGAGC Psol17 JQ924492 F: CACGACGTTGTAAAACGACTATTCCCATGCGAGATGC R: CGGCATAACCACTAAACCAC Psol18 JQ924493 F: CACGACGTTGTAAAACGACACTGTTGTGGACCTTGTTGC R: TGTATTAGGCCCCATCGAC Sumber: Yoshida et al. (2014)
Penentuan hasil PCR dilakukan dengan menggunakan elektroforesis vertikal yaitu akrilamid dimasukkan ke dalam electrophoresis chamber yang berisi buffer TBE 1x dengan memastikan bagian atas gel berada di posisi katoda/kutub negatif. Sejumlah hasil PCR (3-5 µL) ditambahkan dengan loading dye, kemudian dimasukkan ke dalam well. Elektroforesis dilakukan menggunakan gel akrilamid dalam elektroforesis vertikal pada 80 V, selama 60 menit. Gel diwarnai dengan larutan ethidium bromide (atau staining chemical lain) selama 10 menit lalu dibilas dengan ddH2O selama 20 menit. Gel akrilamid dideteksi atau divisualisasi dengan menggunakan sinar UV pada UV Transilluminator. Ethidium Bromide
(EtBr) sebagai pewarna pada proses staining akan berikatan dengan DNA dan cahaya akan berpendar saat terpapar oleh sinar UV. Hasil pendaran tersebut membuat DNA dapat tervisualisasi oleh kamera gel doc kemudian difoto untuk diinterpretasikan.
4.2.4 Analisis Data
Analisis data yang dilakukan meliputi analisis kesamaa dan analisis pengelompokkan. Data hasil pengamatan karakter morfologi (kuantitatif dan kualitatif) menggunakan minitab, sedangkan pola pita DNA diubah menjadi data biner dengan cara scoring. Nilai (1) jika pita ada dan nol (0) jika pita tidak ada. Data biner untuk menghitung nilai kemiripan genetika menggunakan prosedur SIMQUAL (Similarity for Qualitative Data) pada program NTSYSpc versi 2.01 dan dihitung berdasarkan DICE dengan menggunakan rumus Nei & Li (1979).
Seluruh data (pola pita DNA) dianalisis menggunakan prosedur SAHN (Sequencial, Agglomerative, Hierarchical and Nested) dengan metode UPGMA (unweighted pair-group method, arithmetic average) pada program NTSYSpc versi 2.01. Hasil analisis ditampilkan dalam bentuk dendogram.