Penelitian ini dilaksanakan di Rumah Kaca Kebun Percobaan IPB Cikabayan Darmaga, Laboratorium Taksonomi Serangga dan Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret hingga Agustus 2015.
Metode Penelitian Persiapan Penelitian
Identifikasi kutudaun. Kutudaun diperoleh dari pertanaman kacang panjang di Kelurahan Situ Gede, Kecamatan Bogor Barat, Kota Bogor. Identifikasi dilakukan berdasarkan buku identifikasi Blackman dan Eastop (2000), yaitu menggunakan kutudaun yang tidak bersayap (apterae). Karakter yang diamati terdiri dari kepala, abdomen, sifunkuli, kauda, dan antena.
Identifikasi kutudaun dilakukan dengan membuat preparat kutudaun. Pembuatan preparat kutudan mengacu pada Mound (2006). Kutudaun yang tidak bersayap dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 5 mL alkohol 95% dan dipanaskan dalam penangas air selama 5 menit. Kutudaun selanjutnya dimasukkan kembali ke dalam tabung reaksi yang berisi KOH 10% dan dipanaskan hingga terlihat transparan dan dicuci dengan akuades steril sebanyak dua kali. Perlakuan selanjutnya adalah dehidrasi kutudaun, dengan cara merendam kutudaun yang telah dibersihkan dalam alkohol bertingkat secara berurutan mulai dari tingkat kepekatan 50%, 80%, 95%, dan absolut 100% selama 10 menit untuk setiap perendaman. Isi tubuh kutudaun dikeluarkan dengan cara menekan tubuh serangga tersebut menggunakan jarum dibawah mikroskop. Kutudaun yang sudah bersih diletakkan di atas gelas obyek yang diberi larutan hoyer, ditata hingga terlihat bagian-bagian tubuhnya dan ditutup dengan gelas penutup. Pembuatan slide mikroskop kutudaun dilakukan di bawah mikroskop stereo. Bagian-bagian tubuh kutudaun diamati dan diukur panjang masing-masing.
Perbanyakan kutudaun. Kutudaun yang telah diidentifikasi dibebasviruskan pada daun talas (Colocasia esculenta (L.) Schott) yang ujung tangkai daunnya dibalut dengan kapas basah. Kutudaun imago yang tidak bersayap dimasukkan ke dalam cawan petri yang berisi daun talas dan dipelihara hingga imago kutudaun melahirkan nimfa. Nimfa tersebut dipindahkan ke tanaman kacang panjang sehat varietas Parade hingga berkembangbiak untuk digunakan sebagai serangga vektor dalam penularan BCMV. Nimfa yang baru lahir tersebut bebas dari virus (Djikstra dan De Jager 1998).
Perbanyakan inokulum BCMV. Isolat BCMV strain Black-eye Cowpea
(BCMV-BlC) yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat asal Kampung Cangkurawok, Desa Babakan, Kabupaten Bogor yang merupakan koleksi laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman. Tanaman kacang panjang varietas Parade yang berumur 7 HST diinokulasi dengan inokulum BCMV secara mekanis. Daun kacang panjang yang terinfeksi BCMV digerus menggunakan mortar steril dalam 0.01 M bufer fosfat pH 7 yang
mengandung 1% mercaptoethanol dengan perbandingan 1:5 (b/v) sehingga didapatkan cairan perasan (sap). Sap dioleskan di atas permukaan daun yang telah ditaburi carborundum 600 mesh. Pengolesan dilakukan dengan menggunakan jari telunjuk, karena jari telunjuk ini sangat sensitif sehingga penekanan ke permukaan daun dapat disesuaikan dan tidak menyebabkan luka yang terlalu dalam pada permukaan daun (Djikstra dan De Jager 1998). Serbuk carborundum yang masih menempel pada permukaan daun dibilas menggunakan akuades steril yang mengalir.
Penanaman tanaman uji. Kacang panjang yang digunakan adalah kacang panjang varietas Parade. Benih kacang panjang ditanam pada polibag berukuran 30x35 cm yang diisi dengan tanah steril dan pupuk kandang dengan perbandingan 2:1. Setiap polibag ditanami dengan 3 benih kacang panjang. Pada umur 7 HST dipilih satu tanaman dengan pertumbuhan terbaik yang akan digunakan sebagai tanaman perlakuan.
Pembuatan larutan kitosan. Kitosan yang digunakan adalah kitosan murni (Biobasic) yang berasal dari cangkang kepiting (C6H11NO4)n dengan tingkat kemurnian 90% dan sebagai pembanding digunakan kitosan komersial Soft Guard Chitosan Oligo Saccharin dengan kandungan kitosan 2%. Konsentrasi kitosan murni yang digunakan dalam penelitian ini adalah 0.1%, 0.3%, 0.5%, 0.7%, 0.9%, 1.1% (KM 0.1-1.1), dan konsentrasi kitosan komersial 0.9% (KK 0.9). Kitosan murni diencerkan menggunakan asam asetat 1.5% dan aquades steril sedangkan kitosan komersial hanya diencerkan menggunakan aquades steril. Tanaman kontrol hanya disemprot menggunakan asam asetat 1.5%.
Pelaksanaan Penelitian
Uji pengaruh antixenosis kitosan terhadap kutudaun. Tanaman perlakuan yang berumur 2 MST disemprot menggunakan larutan kitosan murni dan larutan kitosan komersial sesuai dengan masing-masing perlakuan menggunakan hand sprayer mini sebanyak 3 ml kitosan/tanaman. Setiap perlakuan terdiri dari 10 ulangan. Tanaman yang telah diberi perlakuan kitosan, dimasukkan ke dalam kurungan kasa dengan susunan melingkar secara acak. Di bawah tajuk tanaman diberi alas berupa kertas karton berwarna putih. Dua puluh empat jam setelah perlakuan, 50 imago kutudaun yang tidak bersayap diinfestasikan pada bagian tengah lingkaran tanaman. Pengamatan jumlah kolonisasi kutudaun pada tanaman perlakuan dilakukan pada 24, 48, dan 72 jam setelah infestasi.
Uji pengaruh antibiosis kitosan terhadap kutudaun. Tanaman perlakuan yang berumur 2 MST disemprot menggunakan larutan kitosan murni dan larutan kitosan komersial sesuai dengan masing-masing perlakuan menggunakan hand sprayer mini sebanyak 3 ml kitosan/tanaman. Setiap perlakuan terdiri dari 10 ulangan. Tanaman diberi sungkup plastik untuk menghindari adanya infestasi serangga lain. Dua puluh empat jam setelah perlakuan setiap tanaman perlakuan diinfestasi 1 ekor imago kutudaun yang tidak bersayap. Imago diamati hingga melahirkan nimfa (keturunan 1). Nimfa yang dilahirkan pertama, kemudian disisakan satu dan lainnya dibuang. Satu nimfa yang telah disisakan tersebut dipelihara dan diamati hingga menjadi imago dan melahirkan nimfa kembali (keturunan 2). Nimfa yang dilahirkan pertama dari keturunan kedua, kemudian disisakan satu dan lainnya dibuang. Satu nimfa yang telah disisakan tersebut
dipelihara, diamati hingga menjadi imago, melahirkan nimfa (keturunan 3), dan mati. Pengamatan dilakukan terhadap lama perkembangan nimfa, periode pre-viviparitas, siklus hidup, lama periode reproduksi, lama hidup imago, dan jumlah nimfa yang dilahirkan (Zeng et al. 1994). Laju multiplikasi (MR) dan laju pertumbuhan intrinsik (rm) dihitung menggunakan rumus:
Laju multiplikasi (MR) = jumlah nimfa yang dilahirkan/lama hidup imago (Kashyap et al. 1988)
Laju pertumbuhan intrinsik (rm) = 0.738 (log masa viviparitas)/jumlah hari mulai dari nimfa dilahirkan hingga melahirkan nimfa kembali (Wyatt dan White 1977)
Uji aktivitas insektisidal kitosan melalui metode semprot langsung terhadap kutudaun. Tanaman perlakuan yang berumur 2 MST diinfestasi 50 nimfa instar-2. Nimfa kutudaun tersebut kemudian disemprot langsung mengenai tubuhnya menggunakan larutan kitosan murni dan larutan kitosan komersial sesuai dengan masing-masing perlakuan menggunakan hand sprayer mini sebanyak dengan 3 ml kitosan/tanaman. Setiap perlakuan terdiri dari 10 ulangan. Tanaman diberi sungkup plastik untuk menghindari adanya infestasi serangga lain. Pengamatan dilakukan terhadap jumlah mortalitas kutudaun dilakukan pada 24, 48 dan 72 jam setelah perlakuan. Lethal Concentration50, 95 dihitung menggunakan analisis Probit (Finney 1971).
Uji aktivitas insektisidal kitosan melalui metode residu terhadap kutudaun. Tanaman perlakuan yang berumur 2 MST disemprot menggunakan larutan kitosan murni dan larutan kitosan komersial sesuai dengan masing-masing perlakuan menggunakan hand sprayer mini sebanyak 3 ml kitosan/tanaman. Setiap perlakuan terdiri dari 10 ulangan. Dua puluh empat jam setelah perlakuan setiap tanaman perlakuan diinfestasi 50 nimfa instar-2. Tanaman diberi sungkup plastik untuk menghindari adanya infestasi serangga lain. Pengamatan dilakukan terhadap jumlah mortalitas kutudaun dilakukan pada 24, 48, dan 72 jam setelah infestasi. Lethal Concentration50, 95 dihitung menggunakan analisis Probit (Finney 1971).
Uji pengaruh penghambat makan kitosan terhadap kutudaun. Tanaman perlakuan yang berumur 2 MST disemprot menggunakan larutan kitosan murni dan larutan kitosan komersial sesuai dengan masing-masing perlakuan menggunakan hand sprayer mini sebanyak 3 ml kitosan/tanaman. Setiap perlakuan terdiri dari 10 ulangan. Dua puluh empat jam setelah perlakuan setiap tanaman perlakuan diinfestasi 3 ekor imago kutudaun yang telah diberi periode puasa selama 30 menit dan periode makan akuisisi selama 30 menit. Kutudaun yang telah makan akuisisi dipindahkan ke tanaman perlakuan untuk periode makan inokulasi selama 120 menit. Kutudaun yang telah makan inokulasi dikoleksi dan dideteksi secara serologi.
Uji pengaruh kitosan terhadap penularan BCMV oleh A. craccivora.
Tanaman kacang panjang yang digunakan dalam perlakuan berumur 1 MST. Sehari sebelum penularan virus menggunakan kutudaun, tanaman disemprot menggunakan larutan kitosan murni dan larutan kitosan komersial sesuai dengan masing-masing perlakuan menggunakan hand sprayer mini sebanyak 3 ml/tanaman. Setiap perlakuan terdiri dari 10 tanaman sebagai ulangan. Keesokan harinya, tanaman diinokulasi BCMV menggunakan kutudaun stadia imago yang tidak bersayap sebanyak 3 imago per tanaman.
Kutudaun yang digunakan merupakan kutudaun yang telah dipelihara yang dipindahkan dari tanaman kacang panjang ke dalam cawan petri untuk periode puasa selama 60 menit. Kutudaun kemudian dipindahkan ke tanaman terinfeksi BCMV yang telah bergejala untuk makan akuisisi selama 30 menit. Kutudaun yang telah makan akuisisi dipindahkan ke tanaman perlakuan sehat yang telah diberi perlakuan kitosan sehari sebelumnya untuk periode makan inokulasi selama 1 malam. Kutudaun kemudian dimatikan, tanaman dipelihara dan disiram setiap hari. Gejala yang muncul diamati setiap hari hingga 1 bulan setelah inokulasi. Peubah pengamatan yang diamati adalah sebagai berikut:
1. Periode inkubasi virus dan tipe gejala.
2. Persentase insidensi penyakit (IP) dihitung dengan rumus:
3. Persentase keparahan penyakit diamati pada 4 minggu setelah inokulasi (MSI). Skor kategori serangan penyakit yang digunakan seperti dilaporkan Megasari
et al. (2014):
Skala kategori serangan penyakit yang digunakan adalah sebagai berikut (Gambar 2):
Skor 0 = Tanaman tidak bergejala
Skor 1 = Gejala mosaik ringan dengan pemucatan tulang daun Skor 2 = Gejala mosaik sedang
Skor 3 = Gejala mosaik berat
Skor 4 = Gejala mosaik berat dengan malformasi daun yang parah, kerdil, atau mati
Gambar 2 Skala kategori serangan penyakit a. Skor 0, b. Skor 1, c. Skor 2, d. Skor 3, e. Skor 4
Deteksi BCMV secara serologi. Deteksi BCMV dilakukan pada 4 MSI. Daun kacang panjang diambil menggunakan tutup eppendorf ukuran 1.5 mL (bobot daun 1 tutup eppendorf = 0.01 g). Setiap perlakuan dibuat tiga sampel komposit. Pengaruh penghambatan makan kitosan terhadap kutudaun dideteksi setelah kutudaun makan inokulasi. Metode serologi yang digunakan untuk deteksi virus dan pengaruh penghambatan makan kitosan terhadap kutudaun adalah metode ELISA tidak langsung (Indirect-ELISA), menggunakan antiserum BCMV (Agdia, USA).
Jumlah tanaman yang bergejala
IP = x 100% Jumlah tanaman yang diamati
Sap tanaman dan sap kutudaun sebagai antigen disiapkan dengan menggerus daun kacang panjang dan kutudaun menggunakan mortar dengan bufer ekstraksi pH 9.6 (1.59 g Na2CO5, 0.293 g NaHCO3, 0.20 g NaN3 yang dilarutkan dalam 1 L air steril) dengan perbandingan 1:100 (v/v). Sebanyak 100 μL sap diisi ke dalam sumuran ELISA. Plat diinkubasi semalam pada suhu 4 ºC. Setelah itu, plat dicuci 8 kali dengan PBST (Phosphate buffer saline tween-20). Tiap sumuran diisi
dengan 100 μL antiserum BCMV (1:200) dalam ECI buffer pH 7.4 (2 g bovine serum albumin, 20 g polyvinylpyrrolidone PVP 40 000, 0.2 g NaN3 yang dilarutkan dalam 1 L air steril). Setelah itu, plat diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 2 jam, kemudian plat dicuci 8 kali dengan PBST. Selanjutnya, masing-masing sumuran diisi dengan 100 μL enzim konjugat RaM-AP (Rabbit Antimouse IgG-Alkaline phosphatase) dalam ECI buffer dengan perbandingan (1:200) dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 ºC. Plat dicuci dengan PBST sebanyak 8 kali. Setelah plat dicuci dengan PBST, tiap sumuran diisi dengan 100 μL substrat PNP (p-nitrophenylphosphate) dan diinkubasi selama 15 sampai 60 menit pada suhu ruang. Perubahan warna diamati pada masing-masing sumuran. Hasil ELISA dianalisis secara kuantitatif dengan ELISA reader pada panjang gelombang 405 nm. Sampel dinyatakan positif jika nilai absorbansi ELISA (NAE) sampel uji 2 kali lebih besar dibandingkan kontrol negatif ELISA.
Ekstraksi RNA total. Ekstraksi RNA total secara manual mengikuti metode CTAB (Doyle dan Doyle 1987). Sebanyak 0.1 g sampel tanaman bergejala (daun) digerus menggunakan nitrogen cair dan ditambahkan 500 µL bufer ekstraksi yang mengandung (1% 2-β-mercaptoethanol). Hasil gerusan dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 mL dan diinkubasi dalam penangas air pada suhu 65 oC selama 30 menit dan setiap 10 menit sekali dibolak-balik untuk membantu proses lisis. Setelah 30 menit tabung yang berisi sap tanaman diangkat dari penangas air dan didiamkan selama 2 menit pada suhu ruang, kemudian ditambahkan 500 µL campuran Chloroform:Isoamilalcohol (CI) (24:1). Agar tercampur dengan baik, sap dan CI divortek dengan kecepatan tinggi selama 5 menit, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10 000 rpm selama 15 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung baru dengan hati-hati, kemudian ditambahkan isopropanol dan sodium asetat (volume sebanding dengan supernatan yang diperoleh). Tabung mikro kemudian simpan pada suhu -80 oC selama 30 menit. Tabung mikro kemudian dibolak-balik sehingga terlihat benang-benang RNA, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 10 000 rpm selama 7 menit. Setelah disentrifugasi akan terlihat pelet RNA total. Campuran supernatan dengan isopropanol dan sodium asetat dipindahkan secara hati-hati sehingga menyisakan pelet RNA. Pelet RNA yang diperoleh dicuci dengan etanol 70% sebanyak 500 µL. Pelet RNA yang telah ditambahkan etanol disentrifugasi dengan kecepatan 10 000 rpm selama 7 menit, etanol dibuang lalu tabung diletakkan secara terbalik diatas tisu selama 15 menit agar pelet kering. Pelet yang diperoleh dilarutkan dalam 50 µL bufer TE 1x (10 mM Tris-HCl pH 8.0 mM EDTA).
Sintesis complementary DNA (cDNA). Produk ekstraksi RNA total digunakan sebagai template untuk sintesis cDNA. Sintesis cDNA melalui proses transkripsi balik RNA dengan menggunakan enzim reverse transkriptase M-MuLV (Moloney Murine Leukimia Virus). Komposisi reagent yang digunakan dalam sintesis cDNA disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1 Komposisi bahan reaksi RT-PCR BCMV
Komponen Volume (µ L)1
Bufer RT 5X
dNTP 10 mM (Thermo Scientific) (10 pmol) DTT 50 mM (Thermo Scientific) (50 pmol)
RNAse Inhibitor (Thermo Scientific) (40 unit/µ L) M-MuLV (Thermo Scientific) (200 unit/µ L) Air bebas nuklease
Oligo d(T) (Thermo Scientific) (10 pmol) RNA total 2.00 0.50 1.00 0.25 0.50 1.75 1.00 3.00 Total Volume 10.00
1 Untuk satu reaksi
Setiap reaksi RT diinkubasi berturut-turut pada suhu 42 oC selama 60 menit dan 70 oC selama 10 menit. Produk RT selanjutnya digunakan dalam tahapan amplifikasi DNA.
Amplifikasi cDNA BCMV. PCR digunakan untuk melipat gandakan satu molekul DNA atau memperbanyak daerah spesifik DNA target. Primer yang digunakan adalah primer spesifik yang mendeteksi gen CP BlC, yaitu BCMV
BlC-cpF (5’-TCA GGA ACT GGG CAG CCG CAA C-3’) dan primer BlC-cpR
(5’-CTG CGG GGA ACC CAT GCC AAG-3’) yang berukuran ~860 pb (Damayanti et al. 2009). Amplifikasi didahului dengan denaturasi awal pada suhu 94 oC selama 5 menit, dilanjutkan dengan 35 siklus yang terdiri dari denaturasi pada suhu 94 oC selama 1 menit, penempelan primer (annealing) pada suhu 68 oC selama 1 menit dan ekstensi pada suhu 72 oC selama 1 menit. Siklus terakhir ditambahkan 7 menit pada suhu 72 oC untuk tahapan sintesis dan siklus berakhir pada suhu 4 oC. DNA hasil PCR dielektroforesis pada gel agarosa.
Amplifikasi Gen PR 1. Primer yang digunakan adalah primer universal PR 1 yaitu PR1-F (5’-TAA CTA TGG AGG TAT CAA GCT GCC-3’) dan primer
PR1-R (5’-CCA GTA CGT ACG CCC GTG TGT ATA A-3’) yang berukuran
~523 pb Kurnianingsih (2008). Amplifikasi didahului dengan denaturasi awal pada suhu 94 oC selama 5 menit, dilanjutkan dengan 39 siklus yang terdiri dari denaturasi pada suhu 94 oC selama 30 detik, penempelan primer (annealing) pada suhu 55 oC selama 30 detik dan ekstensi pada suhu 72 oC selama 2 menit. Siklus terakhir ditambahkan 5 menit pada suhu 72 oC untuk tahapan sintesis dan siklus berakhir pada suhu 4 oC. DNA hasil PCR dielektroforesis pada gel agarosa.
Amplifikasi Gen PR 3. Primer yang digunakan adalah primer universal PR 3 untuk genus Vigna yaitu PR3Vu-F (5’-GCA TGG CCG TTT TCACAT TC-3’)
dan primer PR3Vu-R (5’-CAC ACA GGG AAA GAC GCA GG-3’). Amplifikasi
didahului dengan denaturasi awal pada suhu 94 oC selama 5 menit, dilanjutkan dengan 35 siklus yang terdiri dari denaturasi pada suhu 94 oC selama 1 menit, penempelan primer (annealing) pada suhu 52 oC selama 1 menit dan ekstensi pada suhu 72 oC selama 1 menit. Siklus terakhir ditambahkan 7 menit pada suhu 72 oC untuk tahapan sintesis dan siklus berakhir pada suhu 4 oC. DNA hasil PCR dielektroforesis pada gel agarosa. Komposisi reagent yang digunakan dalam PCR disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2 Komposisi bahan reaksi PCR
Komponen Volume (µL)1
GTG
Primer Forward
Primer Reverse
Air bebas nuklease cDNA 12.50 1.00 1.00 9.50 1.00 Total volume 25.00
1 Untuk satu reaksi
Visualisasi DNA. Visualisasi DNA hasil amplifikasi dilakukan dengan elektroforesis pada gel agarosa 1%. Sebanyak 0.3 g agarosa dicampur dengan 30 mL bufer 0.5 X TBE (Tris borate EDTA) dan dipanaskan dalam microwave
selama 2 menit hingga tercampur rata dan diamkan beberapa menit sebelum dituang pada cetakan. Setelah dituang, agarosa didiamkan selama ± 45 menit hingga mengeras. Setelah terbentuk gel dengan sumuran, sebanyak 5 µL marker
DNA dan 5 µL DNA hasil PCR dimasukkan masing-masing ke dalam sumuran gel dan dilakukan elektroforesis selama 50 menit dengan tegangan 50 volt. DNA yang telah dielektroforesis lalu direndam dalam 5% Ethidium Bromide selama 15 menit dan divisualisasi diatas UV transluminator. Pita DNA yang terbentuk pada saat elektroforesis diambil gambarnya menggunakan kamera digital.
Kuantifikasi intensitas DNA. Kuantifikasi intensitas pita DNA dikonversi menggunakan software ImageJ (imagej.net). Tinggi rendahnya intensitas DNA ditunjukkan dengan tinggi rendahnya histogram.
Rancangan Percobaan dan Analisis Data
Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL). Data yang diperoleh dianalisis dengan sidik ragam (ANOVA) menggunakan program Microsoft Office Excel 2013 dan SPSS versi 20.0 (Statistical Package for Social Sciences, USA). Pengaruh perlakuan yang berbeda nyata dilakukan uji lanjut dengan uji selang berganda Duncan (DMRT) pada taraf nyata 5%.